Александр Панчин - Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей
Рассмотрим организм, у которого на одной из хромосом возникла новая мутация. Каждому потомку организма передается только одна родительская хромосома из пары, поэтому, если скрестить организм с мутацией (на одной хромосоме) и организм без мутации, половина их потомков унаследует генетическое изменение, а половина не унаследует. Если скрестить полученных потомков, несущих мутацию, друг с другом, четверть особей следующего поколения будет иметь мутацию на обеих хромосомах, половина на одной, а четверть окажется вовсе без мутации. Несложно заметить, что это классическое наследование (по Менделю) не очень эффективно в передаче нового “мутантного" варианта потомкам.
В 2015 году в журнале Science вышла статья с описанием “мутагенной цепной реакции”. МЦР – это новый метод быстрого редактирования геномов живых организмов на основе белка Casy319. Он позволяет не только внести какую-то последовательность ДНК в определенное место генома, но и обойти вышеупомянутые законы наследования и добиться того, чтобы в результате скрещивания генетически модифицированного и обычного организма получались только генетически модифицированные потомки, причем с мутацией сразу на обеих копиях хромосомы. Как это сделать?
Мы выбираем место, которое хотим редактировать, и ген, который хотим вставить. Создаем плазмиду, содержащую целевой ген, ген белка Casy и ген специально подобранной направляющей РНК, распознающей желаемое место вставки. Все это обрамляется двумя последовательностями ДНК, комплементарными участкам хромосомы предшествующему и следующему за местом разреза разреза (будущим местом вставки). Плазмида с такой конструкцией переносится в клетку. Внутри клетки синтезируется белок Casy, который связывает направляющую РНК и делает двухцепочечный разрез в комплементарном ей участке одной из хромосом. Клетки не любят разрезы в ДНК (а точнее, “оголенные” концы этих молекул) и пытаются их исправить, снова сшить молекулы.
Иногда для исправления разреза подключается особый клеточный механизм починки ДНК, который в поисках информации о том, как выглядела молекула ДНК до разреза, может обратиться ко второй копии хромосомы. Используя эту информацию, механизм, названный гомологичной рекомбинацией, может проверить, не пропало ли что-нибудь в месте разреза, и восстановить недостающие нуклеотиды.
Если клетка использует для починки вторую копию хромосомы или просто сошьет концы вместе, ничего не изменится. Белок Casy снова сделает разрез, и клетке придется чинить ДНК заново.
С другой стороны, на копию хромосомы очень похожа наша плазмида, так как у нее есть обрамляющие участки, точно совпадающие с участками вокруг разреза! Из-за этих участков система починки ДНК может перепутать плазмиду со второй копией хромосомы и синтезировать копию нашей конструкции (с целевым геном, геном Casy и геном направляющей РНК) в место разреза. Когда вторая копия хромосомы будет разрезана все тем же белком Casy, “дырка” в ДНК исправится за счет копирования участка с первой (уже генетически модифицированной) копии хромосомы или участка с нашей плазмиды. В любом случае обе хромосомы окажутся с нужной нам вставкой.
Когда наша генетически модифицированная хромосома передастся потомку организма, в его клетках тоже будут синтезированы белок Casy и направляющая РНК. В результате вторая копия хромосомы, доставшаяся от другого родителя, тоже будет изменена. Получается, что генетически модифицированная хромосома превращает немодифицированные копии хромосомы в себе подобные, а вставка очень эффективно распространяется в популяции. Если организм с такой вставкой выпустить в окружающую среду, шансы, что вставка распространится, будут очень высоки. А значит, такой подход теоретически можно использовать для инженерии природных популяций – например, для борьбы с разносчиками инфекций.
Представьте, что мы создадим генетически модифицированных комаров, не переносящих малярию из-за внесенного в их геном изменения, но способных скрещиваться с обычными малярийными комарами. Выпустив таких комаров в окружающую среду, мы сможем запустить мутагенную цепную реакцию и преобразовать популяцию опасных кровососущих насекомых в безобидных кровососущих насекомых. Новый генетический вариант со временем вытеснит старый.
Другое теоретическое применение технологии – избавление человечества от наиболее распространенных наследственных заболеваний. Мы можем не просто исправить дефект в ДНК, но сделать так, чтобы хромосома, доставшаяся ребенку от генетически модифицированного родителя, исправляла аналогичный дефект на хромосоме, доставшейся ему от второго родителя. Это значит, что можно свести к минимуму число вредных и опасных мутаций в нашей популяции и значительно уменьшить риск большинства генетических заболеваний. Однако это уже будет довольно опасный эксперимент, ведь CRISPR/Casy может не только исправить дефекты, но и внести по ошибке какие-то новые нежелательные мутации в геном.
В 2015 году ученые из лаборатории репродуктивной медицины Университета Сунь Ятсена в Китае опубликовали в журнале Protein Cell результаты изменения ДНК эмбрионов человека с помощью CRISPR/Casy системы320. Ученые показали, что можно направленно редактировать геном человеческих эмбриональных клеток, однако метод CRISPR/Casy был недостаточно эффективным и точным – нежелательное редактирование происходило в разных частях генома. Тем не менее принципиальная возможность генной инженерии людей таким методом была продемонстрирована.
Хотя никто не собирался выращивать генетически модифицированных людей из этих (заведомо нежизнеспособных) эмбрионов, публикация вызвала огромный общественный резонанс, и целый ряд стран ввел запреты на такое использование технологии. Тем лучше для Китая – если они достигнут успеха в этой области, то в будущем богатые люди, желающие завести генетически модифицированных детей, просто наведаются к ним “в гости” и внесут ощутимый денежный вклад в развитие китайской биомедицины.
Конечно, генная модификация людей сильно отличается от генной инженерии других организмов тем, что мы не можем позволить себе риск рождения несчастного ребенка-мутанта из-за ошибки технологии. Это не генетически модифицированные растения и бактерии, которых мы можем легко выкинуть и заменить, если что-то пойдет не так. Собственно, при обычной генной инженерии мы тоже получаем организмы, у которых вставка произошла не там, где надо, но мы можем создать сотни разных генетически модифицированных особей, прочитать их ДНК и отобрать удачные варианты, с которыми все в полном порядке.
Но можно ли проводить редактирование ДНК более точно? Направляющая РНК позволяет белку Casy узнать в геноме фрагмент ДНК длиной около двадцати нуклеотидов. Для узнавания не требуется 100 % комплементарно-сти между направляющей РНК и геномным фрагментом, поэтому Casy иногда режет не там, где предполагалось, – с этой проблемой и столкнулись китайские ученые, пытавшиеся редактировать геном эмбриона человека. Но еще в 2013 году в журнале Cell вышла статья, в которой было предложено усовершенствование белка Casy, позволяющее существенно снизить вероятность ошибки.
Авторы статьи получили мутантный вариант Casy, который разрезает не две цепочки молекулы ДНК, а только одну321. Казалось бы, как такой “испорченный” фермент сможет работать лучше обычного? Дело в том, что вместе с мутантным Casy используется не одна направляющая РНК, а две, узнающие два соседних участка ДНК. Система починки ДНК в клетке легко “запаивает" одноцепочечный разрез в молекуле ДНК, но если такой разрыв произойдет одновременно в двух соседних местах обеих цепей, мы получим эффект, аналогичный действию ферментов рестриктаз, с разделением одной молекулы ДНК на две (места разрезов показаны символом <>).
Теперь для редактирования генома недостаточно, чтобы одна направляющая РНК узнала какой-то его участок. Нужно, чтобы две направляющие РНК узнали два соседних участка генома. Такая система редактирования генома узнает не 20 нуклеотидов, а 40, а значит, специфичность метода существенно возрастает. Еще более надежный метод был предложен в 2014 году в журнале Nature Biotechnology сразу двумя группами исследователей322, 323. Существует белок, который называется нуклеаза FokI, способный разрезать ДНК. Белки FokI разрезают ДНК только в том случае, если два таких белка соберутся вместе, образуя “супербелок”. Примерно как в детских мультиках, где непобедимый робот собирается из нескольких маленьких роботов, каждый из которых по отдельности не может одолеть врага.
