Александр Панчин - Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей
В арсенале генного инженера есть целый набор белков-ферментов, умеющих разрезать и сшивать молекулы ДНК. Как и GFP, эти ферменты были придуманы не учеными, а различными живыми организмами в процессе эволюции, а мы лишь позаимствовали их, приспособив под собственные нужды. Например, белок EcoR1, выделенный из кишечной палочки, относится к группе ферментов, разрезающих ДНК, которые называются рестриктазами. EcoR1 разрезает участок молекулы ДНК, если он выглядит так:
Причем разрезание происходит после буквы G верхней цепи и перед буквой G нижней цепи, как показано ниже.
Полученные концы молекул называются “липкими”, потому что они комплементарны друг другу и охотно готовы слипнуться обратно, но для того, чтобы их снова сшить вместе, нам потребуется еще один фермент – ДНК-лигаза. Ученые нашли уже сотни разных видов рестриктаз, которые могут разрезать совершенно разные фрагменты ДНК. Некоторые рестриктазы узнают короткие (часто встречающиеся) последовательности. С их помощью молекула ДНК будет разрезана сразу во многих местах, и получатся короткие фрагменты. Рестриктазы, узнающие длинные последовательности нуклеотидов, используются, чтобы разрезать ДНК на более крупные куски. Одни рестриктазы разрезают ДНК в том участке, который они непосредственно распознают, другие могут делать разрез на некотором расстоянии от узнаваемого ими места. Бывает, что рестриктазы оставляют не “липкие” концы, а “тупые”, как показано ниже.
Вырежем нужный нам фрагмент ДНК с помощью двух рестриктаз. Добавим вырезанный фрагмент к плазмиде, в которой были сделаны разрезы такими же рестриктазами. “Липкие” концы плазмиды и нашего фрагмента сблизятся по принципу комплементарности, а ДНК-лигаза их сошьет. В итоге мы получим плазмиду со вставкой.
Зачем бактериям рестриктазы и не могут ли они порезать свой собственный геном? Оказывается, что эти ферменты – отличное средство от чужеродной ДНК. Допустим, у бактерии есть рестриктаза, которая узнает фрагмент GAATTC и разрезает его. Сама бактерия пришла к такой рестриктазе постепенно, в процессе длительной эволюции, поэтому у нее в геноме крайне мало участков GAATTC. Кроме того, у нее могут быть особые ферменты, которые находят участки GAATTC и прикрепляют к ним метильные группы (из атома углерода и трех атомов водорода). Эта химическая модификация – она называется метилированием – защищает ДНК от действия некоторых рестриктаз.
Если же в бактерию проникнет неприспособленный бактериофаг, то, вероятно, в его геноме найдется незащищенный участок GAATTC и вирус будет беспощадно разрезан.
Для завершения задуманного генно-инженерного проекта понадобятся правильные бактерии. В обычных условиях менее одного процента бактерий готовы захватывать плазмиды. Для того чтобы увеличить эффективность передачи плазмид, бактерии стоит предварительно подвергнуть тепловому шоку. Сначала их держат в прохладных условиях, а потом ненадолго помещают в инкубатор с температурой в районе 42 градусов (разумеется, конкретные значения зависят от вида используемых бактерий). Многие бактерии в результате такого шока переключаются в особый режим, в котором они начинают хватать всякую ДНК из окружающей среды в надежде найти что-нибудь, что поможет им приспособиться и выжить. В природе это способствует повышению генетического разнообразия популяции бактерий, а значит, возрастают шансы, что какие-то особи переживут неблагоприятные условия. Вот таких напуганных бактерий мы и перемешаем с плазмидой, а затем с антибиотиком. Бактерии, захватившие плазмиду с правильной вставкой, обретут устойчивость и выживут, а остальные погибнут.
Генетически модифицированных бактерий мы можем размножать дальше и использовать в разных целях. Если речь идет не о научных, а о развлекательных задачах, то разбавленными бактериями с генами флуоресцентных белков можно рисовать на поверхности из застывшей питательной среды. Причем если вывести бактерий с флуоресцентными белками разных цветов, рисунки можно делать цветными. Нанесенные бактерии со временем размножатся, и, посветив ультрафиолетом на наш “холст”, мы увидим разноцветные картины. Подобные развлечения практикуются на занятиях в некоторых продвинутых зарубежных школах. Правда, обычно школьников не заставляют придумывать собственные плазмиды. Им предлагают уже готовые, проверенные плазмиды, с нужными генами и известным эффектом. Просто добавь бактерий! Подобным рисованием увлекаются не только дети, но и взрослые художники. В частности, создавались репродукции известных картин, таких как “Крик” Эдварда Мунка, “Большая волна в Канагаве” Кацусики Хокусая, “Звездная ночь” Винсента ван Гога, нарисованные при помощи бактерий.
Генетически модифицировать растения и животных с помощью плазмид проблематично. Дело в том, что для размножения плазмид внутри клеток должны присутствовать специальные белки. У бактерий они есть, но у растений и животных они отсутствуют. Мы можем засунуть бактериальную плазмиду в клетку и даже заставить ее гены работать, но если клетка будет делиться, со временем большинство ее потомков окажутся без плазмиды. Именно поэтому методы генной инженерии растений и животных чаще всего требуют внедрения конструкции непосредственно в геном.
В связи с этим пора перейти к более серьезному вооружению для генной модификации. Например, к генной пушке! Звучит фантастично, не правда ли? Похожим образом (согласно легенде) рассудили в компании Monsanto, когда к ним впервые пришли с такой идеей. Представители компании послали изобретателей на все четыре стороны, и эта ошибка обошлась впоследствии в миллионы долларов. В 1987 году в журнале Science вышла статья, доказывающая, что генная пушка реальна, работает и доставляет кусочки ДНК, содержащие гены, в живые клетки307. Первая генная пушка была похожа на ружье 22-го калибра, стреляющее холостыми патронами. Пороховой взрыв приводил в движение нейлоновый снаряд. Снаряд начинал двигаться вдоль ствола пушки, толкая перед собой микроскопические частички вольфрама, на которые нанесены фрагменты двухцепочечной ДНК. В конце ствола стояла стальная пластина, которая останавливала нейлоновый снаряд, а частицы с генами пролетали через отверстия в пластине диаметром в миллиметр каждое. Скорость полета частиц могла достигать тысячи километров в час! Пролетев сквозь клеточные стенки и мембраны, фрагменты ДНК, содержащие гены (со всеми необходимыми промоторами), начинали работать, а иногда, оказавшись рядом с наследственным материалом клеток, встраивались в их геном.
Генная пушка – это универсальный метод, позволяющий доставлять ДНК (или РНК) практически в любые клетки, будь то клетки животных, растений или бактерий. Основным недостатком метода до недавнего времени считалась стоимость генной пушки, которая могла доходить до 15 тысяч долларов. Однако “биохакер” Рюдигер Тройок создал ее упрощенный аналог ценой всего в 50 евро. Сначала он попробовал смастерить пушку, в основе которой лежали найденная в лесу деревянная палка, электрические клапаны (их он откопал в каком-то мусорном баке), капсула для накачивания велосипедных шин со сжатым углекислым газом, дешевый микроконтроллер и пластиковые трубки. Ствол пушки был сделан из корпуса пишущей ручки и с помощью трубки соединен с клапаном, внутри которого были расположены частички золота, смазанные ДНК и помещенные на пластиковый носитель.
Когда первый прототип не выдержал созданного в нем давления и сломался, Тройок просто соединил ствол своей генной пушки с распылителем для взбитых сливок (баллончик с веселящим газом, находящимся под давлением) – и готово. По заявлению Тройока, устройство могло придать частицам достаточную скорость для проникновения внутрь клеток лука. Конечно, эта пушка далека от совершенства, но сделать недорогую высококачественную генную пушку в принципе возможно, и скоро они появятся в широком доступе, если на них будет увеличиваться спрос.
Еще одна особенность генной пушки заключается в том, что фрагменты ДНК могут попадать в самые разные части клетки. В том числе в митохондрии, хлоропласты и другие внутриклеточные структуры. Это нежелательно, если мы хотим модифицировать ядерную ДНК клетки, но полезно, если мы хотим внести ген в сами митохондрии или хлоропласты308. Нежелательный эффект – обстрелянные из генных пушек клетки могут повреждаться. Какие-то клетки получат частички с ДНК, а какие-то мы просто повредим напрасно. Некоторым клеткам не достанется ни одной молекулы ДНК, а другим десятки. Наконец, ДНК встроится в геном лишь небольшой части клеток. Впоследствии придется тщательно отбирать те уцелевшие клетки, в которых генная модификация прошла успешно.
