Вячеслав Тарантул - Имя ему СПИД: Четвертый всадник Апокалипсиса
Для подавления работы того или иного вирусного гена обычно с помощью генной инженерии конструируют искусственный ген (назовем его условно Анти-ГЕН), на котором молекула РНК синтезируется не с той цепи, как положено, а с противоположной (рис. 31 Б). На таком гене образуется РНК, которая является антисмысловой (т. е. комплементарной) мРНК. В силу существующей комплементарности вирусная РНК и искусственная антисмысловая РНК образуют в клетке комплекс, состоящий из двух связанных между собой цепей РНК. Вхождение вирусной РНК в такой комплекс должно препятствовать ее нормальной работе в рибосоме. Она теряет способность обеспечивать синтез того белка, который кодирует. Другими словами, РНК есть, а белка нет. В результате определенные вирусные белки не синтезируются в клетке, и без них вирус теряет способность размножаться и создавать новые вирусные частицы.
В качестве мишений для действия антисмысловых РНК уже испытаны как различные вирусные гены, так и некоторые клеточные гены, «помогающие» вирусу размножаться. В частности, хорошей мишенью оказался ген, кодирующий белок-рецептор CCR5, подавление которого препятствует проникновению вируса в клетку. Анти-ВИЧ-активность присуща и антисмысловой РНК для гена циклофолина А, продукт которого не важен для жизни клетки, но который очень важен для размножения вируса. Возможности использования такого приема для подавления репликации ВИЧ уже показаны на различных простых системах (в частности, в культуре клеток, инфицированных ВИЧ). Не исключено, что по мере совершенствования противо-ВИЧ-антисмысловых конструкций они найдут применения в лечебной практике.
Рис. 31. Применение антисмысловых молекул РНК основано на их способности образовывать двунитевые гибриды (дуплексы) с мРНК и этим препятствовать их трансляции, т. е. образованию белка (А). Ген (участок ДНК, кодирующий белок) состоит из двух комплементарных цепей ДНК (смысловой и антисмысловой) (Б). В ядре клетки транскрибируется антисмысловая цепь, в результате чего образуется комплементарная ей смысловая матричная РНК (мРНК). На ней в результате трансляции синтезируется кодируемый геном белок. Если искусственно сконструировать такой ген (Анти-ГЕН), у которого происходит транскрипция не антисмысловой, а смысловой цепи, то при одновременной работе гена и Анти-ГЕНа образующиеся в клетке мРНК и антисмысловая РНК в силу комплементарности должны формировать двуцепочечные структуры (дуплексы) (В). Находясь в составе дуплекса, мРНК не способна к трансляции, т. е. к синтезу белка, который она кодирует. В результате этого соответствующий белок не образуется в клетке. Если антисмысловая РНК направлена на вирусную мРНК, то синтез этого белка не происходит и ВИЧ не может размножаться
Рибозимы
На модельных системах уже опробован и другой вариант подавления ВИЧ-инфекции. Для этой цели используется необычное свойство некоторых молекул РНК — их способность разрушать другие виды РНК. Американцы Т. Чех и С. Альтман за это открытие получили в 1989 г. Нобелевскую премию. И было за что. Ведь до этого считалось, что все биохимические реакции в организме происходят с необходимыми для обеспечения жизни скоростями благодаря высокоэффективным специфическим катализаторам, которыми служат только белки, называемые ферментами. И тут совершенно неожиданно сообщается о существовании в природе некоторых видов РНК, которые подобно белкам обладают высокоспецифической каталитической активностью. После того как стало известно, что определенные РНК обладают ферментативной активностью, их стали называть рибозимами. Рибозимы содержат внутри себя все те же антисмысловые участки, но, кроме того, и участки, осуществляющие ферментативную реакцию. То есть они не просто присоединяются с мРНК, а еще и разрезают ее. Суть приема подавления ВИЧ-инфекции с помощью рибозимов изображена на рис. 32. Присоединяясь к комплементарной РНК-мишени, рибозим расщепляет эту РНК, результатом чего является прекращение синтеза белка, кодируемого РНК-мишенью. Если такой мишенью для рибозима будет вирусная РНК, то рибозим ее «испортит», и соответствующий вирусный белок образовываться не будет. А в результате вирус прекратит свое размножение в клетке. Такой подход в равной мере применим и к некоторым другим патологиям человека, например для лечения рака.
Рис. 32. Подавление вирусной инфекции с помощью рибозимов основано на их способности связываться с определенными участками вирусной мРНК и разрезать ее на куски. B результате исчезновения целостной полноразмерной мРНК синтез соответствующего ей белка происходить не может. Это предотвращает размножение вируса
РНК-интерференция
Серьезные надежды возлагаются в последнее время еще на одно очень интересное направление — избирательное подавление синтеза вирусных белков с помощью механизма РНК-интерференции. B связи с этим сделаем небольшое, но важное отступление.
Давно было известно, что в клетках существует специальный механизм, который мешает распространению вирусной инфекции. Он даже получил свой термин — интерференция. Белки, которые участвуют в этом процессе, были названы интерферонами. B ответ на введение в клетки фрагментов нуклеиновой кислоты длиной более тридцати нуклеотидов (геном всех вирусов имеет больший размер) в их цитоплазме запускается мощный интерфероновый ответ, блокирующий весь белковый синтез (т. е. в данном случае происходит защитный ответ клетки на вирусную инфекцию, который является не специфическим на определенный агент, а общим). И вот недавно открыт совершенно новый способ регуляции работы генов в клетках — механизма РНК-интерференции. Выяснилось, что в клетке существует специальный механизм, способный деградировать строго определенные РНК (без участия рибозимов) и таким образом полностью инактивировать ее. Этот механизм деградации может быть направлен на любую конкретную РНК — клеточную, бактериальную или вирусную. Суть механизма РНК-интерференции заключается в том, что при введении в клетки короткой двуните-вой РНК (днРНК) она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Как теперь выяснено, сначала днРНК разрезается специальным ферментом на короткие фрагменты размером от 19 до 21 пар нуклеотидов. После небольших химических модификаций эти короткие днРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками. B этом комплексе днРНК расплетается и становится однонитевой. Затем короткая однонитевая РНК в силу своей комплементарности взаимодействует со строго определенной мРНК (копией гена-мишени), что является сигналом для «разрезания» последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже неспособны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные днРНК, можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.
Открытие РНК-интерференции имело большое значение для всей теоретической молекулярной генетики. Но, как и большинство других крупных открытий, сразу же возникла идея о применении новой технологии в человеческой практике и, в частности, для лечения различных заболеваний. Вполне естественно, что вскоре стали размышлять над использованием этого природой созданного свойства — интерференции — и для борьбы с ВИЧ (рис. 33). Первые попытки применить РНК-интерференцию в качестве нового подхода к терапии ВИЧ-инфекции появились в 2002 г. Для того чтобы использовать механизм РНК-интерференции в клетках млекопитающих, внутрь клеток нужно ввести уже готовые двухцепочечные молекулы РНК. Оптимальный размер таких синтетических РНК составляет те же 21–28 пар нуклеотидов. Если увеличить ее длину — клетки ответят выработкой интерферона и снижением синтеза белка. Но молекулы РНК синтезировать трудно, они не очень стабильны. Поэтому на практике пользуются возможностями, предоставляемыми рекомбинантными ДНК, которые, будучи перенесенными в клетки, обеспечивают синтез таких днРНК.
С целью воздействия на ВИЧ сейчас уже опробовано несколько вариантов РНК-интерференции. Если первоначально для подавления вируса использовали интерферирующие РНК к вирусным мРНК, то в дальнейшем пришли к выводу, что более целесообразным является направлять днРНК на клеточные мРНК, такие как, например, мРНК, кодирующие вирусный рецептор CD4 и/или корецептор CCR5. Дело в том, что вирусные гены быстро видоизменяются, соответственно изменяется нуклеотид-ная последовательность вирусной РНК. В результате этого конкретная искусственно синтезированная интерферирующая РНК очень быстро становится малоэффективной к некоторым вариантам вируса. Клеточные же гены, обеспечивающие взаимодействие вируса с клеткой, стабильны (они изменяются чрезвычайно редко). По этой причине подавление их работы с помощью интерферирующих РНК происходит более надежно. Внимание было обращено на клеточные белки-рецепторы или корецепто-ры для ВИЧ. Если предотвратить синтез хотя бы одного из них, вирус не сможет проникать в клетку. На клетках, которые растут вне организма (in vitro), уже были использованы обе стратегии, и все они дали существенный положительный результат. Так, показано полное подавление инфицирования ВИЧ макрофагов с помощью комбинации коротких интерферирующих днРНК, направленных против клеточных и вирусных генов. Однократное применение днРНК обеспечивало долгосрочную защиту этих неделящихся клеток от вируса. Обнаружена также возможность подавления размножения ВИЧ в уже инфицированных клетках. Использование интерферирующих РНК имеет целый ряд преимуществ по сравнению с антисмысловыми РНК (большая эффективность, меньшая токсичность).
