Вячеслав Тарантул - Имя ему СПИД: Четвертый всадник Апокалипсиса
Иммуноблоттинг — дополнительный непрямой метод
Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.
Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется — делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.
Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если
Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело — меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).
B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.
ПЦР — высокочувствительный прямой метод
Аббревиатура ПЦР расшифровывается «полимеразная цепная реакция». За создание этого потрясшего мир метода ее первооткрывателю Керри Мюллису в 1993 г. была присуждена Нобелевская премия. Все гениальное — просто. Это можно сказать и о ПЦР. За свою чувствительность, изящность и точность новый метод с быстротой молнии распространился по всему миру. B настоящее время ПЦР используется для проведения научных и практических исследований, но прежде всего этот метод нашел широкое применение в области вирусной и микробиологической диагностики. ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков — несколько сотен пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро многократно размножить его.
ПЦР имеет мало общего с хорошо всем известной ядерной цепной реакцией, происходящей при делении атомных ядер под действием нейтронов. Общность заключается только в том, что в обоих случаях реакция цепная, т. е. очень сложная, усиливающаяся в геометрической прогрессии. По сути дела, метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю. Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках — коротких двунитевых участках. Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке, используют две генетические пробы (праймеры), которые и служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры — это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15–30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис. 28 .
Рис. 28. Метод ПЦР весьма чувствительный, его проведение требует большой предосторожности. Необходимые пояснения см. на рисунке и в тексте.
Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100о С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ученые говорят — ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые «стартовые» участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент — Taq-полимераза. Кроме способности синтезировать ДНК эта полимераза обладает еще одной важной особенностью: она устойчива к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro (т. е. в пробирке) синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100о С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция ПЦР. В результате такого «тиражирования» в пробирке уникальных участков генов вируса или бактерий за два-три часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такое количество ДНК уже достаточно, чтобы визуально ее регистрировать с помощью простых приемов, которые уже давно используются молекулярными биологами.
С момента возникновения метод ПЦР постоянно совершенствовался, и в настоящее время он позволяет выявлять в биологических объектах даже единичные вирусные частицы или бактерии. Чувствительность амплификационных тест-систем составляет от 1 до 100 вирусов, в то время как чувствительность иммунологических (не говоря уж о микроскопических) тестов на два-четыре порядка ниже. Кроме того, ПЦР имеет высокую специфичность, которая обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида возбудителя, фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения к матрице при проведении реакции. Соответственно, амплификационные тест-системы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно реагирующими антигенами. И наконец, привлекательна быстрота получения результата при использовании ПЦР. За счет автоматизации определение возбудителя осуществляется обычно в течение одного рабочего дня. Правда, очень высокая чувствительность метода имеет и обратную сторону медали: реакция может происходить и при наличии незначительных примесей, случайно попавших в рабочие растворы, на инструменты и даже на хорошо вымытую посуду. От исследователей требуется сверхтщательное отношение к постановке эксперимента, особая культура в технологии проведения подобного рода анализа. Даже наличие одной молекулы вируса, случайно внесенной в реакцию извне (порой даже из воздуха), может дать положительный сигнал, хотя на самом деле в анализируемой крови вирус отсутствует (такой сигнал, как уже говорилось, называется ложноположительным).
