Юрий Скрипкин - Инфекции, передаваемые половым путем
Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроцитов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроцитов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).
Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.
Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик. При этом на первой клавише (слева) учитывается число полей зрения, а на последней клавише (справа) – число трепонем в 10 полях зрения. При просмотре препарата под микроскопом учитываются только те бледные трепонемы, которые могут свободно перемещаться с током жидкости. Те же трепонемы, которые попали в поле зрения с током жидкости дополнительно, после начала подсчета («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент прилипания бледных трепонем исчисляется по формуле:
(100 – Оn) /K х 100,
где On – число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки; К – число бледных трепонем в 10 полях зрения из контрольной пробирки.
При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0-20%, результат расценивается как отрицательный; 21-30% – как сомнительный; 31-50 % – слабоположительный и при 51-100%-как положительный. В ответе результат реакции выписывается без указания процента. В случае несовпадения результатов РИП сданными других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом, повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повторить РИП с сывороткой крови, взятой у обследуемого повторно.
РИП следует применять в следующих случаях: при диагностике тех форм сифилиса, когда на основании данных анамнеза, клиники, результатов КСР и других исследований не удается подтвердить диагноз заболевания; при дифференцировании неспецифических результатов КСР; при контрольном наблюдении после окончания лечения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.
Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА). Принцип метода заключается в следующем: формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются с экстрактом из патогенных бледных трепонем. Образующийся комплекс, который фиксируется на эритроцитах, составляет корпускулярный антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов. Антигеном для этой реакции являются эритроциты барана или индюка, покрытые частицами бледных трепонем от зараженных кроликов, а затем фрагментирован-ные ультразвуком. Адсорбирующий разбавитель (состоит из фрагментов эритроцитарных мембран барана либо индюка и быка, трепонем Рейтера, ткани семенников кролика, кроличьей сыворотки) заливают в лунки пластин, куда затем вносят инактивированную сыворотку. Разбавитель связывает неспецифические групповые антитела. Специфические иммуноглобулины к бледным трепонемам вызывают агглютинацию. Предварительный результат может быть зарегистрирован после инкубации в течение 3-4 ч. Появление равномерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного цвета в виде пятна или кольца является показателем осаждения эритроцитов. ТРПГА-тест, выполняемый вручную или автоматизированным методом, является достаточно специфичным и чувствительным тестом.
Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА-ТР) является вариантом ТРПГА. Ее ставят на пластинках для микротитрования. Она требует по сравнению с ТРПГА намного меньшего количества сыворотки, адсорбирующего разбавителя и антигена. Окончательный результат получают уже после 4 ч инкубирования сыворотки. Автоматизированная реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (АМНА-ТР) благодаря автоматизации процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки еще проще и обходится еще дешевле, чем реакция АМН-ТР. Она особенно пригодна при массовых обследованиях на сифилис.
Клиническая оценка результатов серологических реакций.
При первичном серонегативном периоде сифилиса бывают положительными РИФ и реакция Колмера как наиболее чувствительные серореакции. Однако это не является основанием для постановки таким больным диагноза первичного серопозитивного сифилиса. У ряда больных в этом периоде бывает изолированный положительный результат при постановке реакции Вассермана с трепонемны-ми или с кардиолипиновым антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся положительными стандартные серологические реакции – с этого момента начинается первичный серопозитивный период сифилиса. На 1-2-й неделе первичного серопозитивного сифилиса отмечается увеличение степени позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарастание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера уже у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ, как правило, отрицательная или процент иммобилизации очень низок. Диагноз первичного серопозитивного сифилиса ставится и тем больным, у которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспецифическими антигенами дали даже однократный слабоположительный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции становятся резко положительными (4+); титр реагинов достигает 1:80, 1:160, РИФ продолжает быть резко положительной, но РИБТ у большинства больных еще остается отрицательной или может стать слабоположительной.
При вторичном свежем сифилисе резко положительный результат по всем стандартным серологическим реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок – 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ – 4+; РИБТ дает положительнй результат более чем у половины больных, однако процент иммобилизации трепо-нем невысок (40-60%).
При вторичном рецидивном сифилисе положительный результат по стандартным серологическим реакциям отмечается в 96-98% наблюдений. Отрицательные результаты могут иногда объясняться малосимптомным рецидивным течением, наличием астенизации и сочетанием сифилиса и ВИЧ-инфекции. РИБТ дает положительный результат у 85-90% больных при выраженной степени иммобилизации – 80-90-100%.
Третичный сифилис характеризуется положительными результатами по стандартным серологическим реакциям в 50-90% наблюдений и положительной РИБТ у 92-100% пациентов с высоким процентом иммобилизации.
Диагноз скрытого серопозитивного сифилиса, как указывалось выше, устанавливают только по положительным серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, так как только РИБТ (и в меньшей степени РИФ) позволяет отдифференцировать ложноположительные серореакции (даже с позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.
Разные формы сифилиса нервной системы и висцерального сифилиса имеют различную частоту и выразительность стандартных серореакции. Так, прогрессивный паралич в 100% случаев сопровождается резко положительными всеми стандартными серологическими реакциями. Сифилис сосудов мозга, спинная сухотка, сифилитическое поражение сердечно-сосудистой системы сопровождаются положительными серореакциями лишь в 40-50-60% наблюдений. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологических состояниях дает резко положительный результат (90-100% иммобилизации).
При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес после рождения стандартные серологические реакции у ребенка не определяют, т. к. они могут быть положительными за счет пассивной передачи реагинов через плаценту. По этой же причине не имеет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно переданные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес после рождения. Если ребенок инфицируется незадолго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной (в связи с более поздним образованием иммобилизинов), несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.
