Юрий Скрипкин - Инфекции, передаваемые половым путем
Положительный результат РИБТ наблюдается у больных с тропическими трепонематозами (пинта, беджель). Иногда РИБТ дает ложноположительный результат при саркоидозе, эритематозе, туберкулезе, циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.
Упрощенная методика РИБТ (Методика разработана проф. Н. М. Овчинниковым.). Кровь для получения сыворотки берут из вены стерильно в сухую чистую и простерилизованную посуду. Больной перед взятием крови не должен принимать никаких лекарственных средств, которые могли бы оказать вредное влияние на подвижность трепонем; в частности, необходимо прекратить введение дюрантных препаратов пенициллина на срок возможной задержки его в организме. Инактивация сыворотки производится в течение 30 мин при температуре 56 °С, а если сыворотка была инактивирована накануне, то в день постановки реакции ее прогревают в течение 10 мин. Никаких консервантов в сыворотку не добавляют. При необходимости длительного хранения сыворотку можно заморозить при –20 °С. Сыворотки, высушенные на вощаной бумаге (с добавлением свежеприготовленного 40 % пищевого сахара по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки), можно в отдельных случаях применять для исследования. Следует, однако, учитывать, что титр иммобилизинов снижается при высушивании сыворотки подобно реагинам и при невысоких титрах снижение может быть значительным. Поэтому не следует широко пользоваться в РИБТ высушенными сыворотками.
Срок годности для исследования высушенной сыворотки 5 дней с момента приготовления в южных районах нашей страны или в жаркое время года и 10 дней – в остальных регионах. Сыворотка нативная, хранящаяся в холодильнике при температуре +3…+5°С, также теряет свою активность.
В качестве антигена применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита кролика, зараженного сифилисом, обычно штаммом Никольса. Для заражения следует брать совершенно здоровых кроликов-самцов массой 2-2,5 кг, предварительно исследовав у них кровь на реакцию Вассермана. Отбирают только кроликов с отрицательными результатами серологических реакций. Заражение производят внутрь яичка взвесью трепонем в количестве не менее 50-60 в поле зрения в объеме 0,50-0,75 мл. Непосредственно после заражения кролику вводят внутримышечно 20 мг кортизона, а в последующие дни – по 10 мг ежедневно. Рекомендуемое рядом исследователей одновременное рентгеновское облучение кроликов трудно для выполнения и не дает существенных преимуществ.
Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привязывают к станку, обескровливают сердечной пункцией (некоторые предпочитают обескровливать через сонную артерию). Затем забивают кролика воздушной эмболией (введение 15 см3 воздуха в краевую вену уха). Яички выводят в мошонку путем поглаживания ладонью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошонки, предварительно немного подстриженной ножницами, смазывают спиртом, поджигают, тут же тушат и опять поджигают. Этим достигаются освобождение кожи от шерсти и одновременно дезинфекция кожи. После этого мошонку покрывают резиновой стерильной салфеткой с разрезом, через который выводят наружу яичко. Оператор фиксирует яичко одной рукой, а другой рукой делает скальпелем небольшой поперечный разрез кожи мошонки. Ножницами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри. Такого же рода манипуляцию проделывают и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, освобождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора натрия хлорида и определяют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки помещают в стерильную колбу объемом 50-75 мл, в которую уже налита среда (сыворотка кролика, разведенная 0,83 % стерильным раствором натрия хлорида, в количестве 10-14 мл на яичко). Колбу ставят в аппарат для встряхивания на 20-30 мин. После этого все содержимое выливают в большую стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков тканей. Затем надосадочную жидкость сливают и готовят препараты для микроскопии. Определяют число трепонем в темном поле зрения (окуляр 10, объектив 40). Если число трепонем большое, то взвесь следует развести, чтобы было по 10-15 трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать иммобилизованные трепонемы.
Обычно в центрифужной пробирке над осадком оставляют некоторое количество жидкости и дают возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заражают кроликов для следующей постановки реакции. При каждой постановке следует одновременно производить и заражение. Зараженных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18…20°С. Пища кроликов должна содержать значительное количество витаминов.
Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено большое количество различных сред (Овчинников Н. М., 1961).
Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применяют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворотку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешенные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвижность менее активна, и наблюдается значительное количество сомнительных результатов.
Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептомицина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыворотки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употреблении новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижераторе.
На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохранения. Особенно следует обращать внимание на возможность у кроликов спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться положительные результаты реакции или спонтанная агглютинация трепонем.
При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1 % стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.
Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества комплемента, что в значительной степени зависит от примененной среды. При пользовании одной и той же средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а чем меньше комплемента, тем больше подвижных трепонем. При употреблении желатиновой среды оптимальное количество комплемента равно 0,15 мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий, полученный от морской свинки. Консервированный комплемент непригоден.
Техника постановки реакции. Пронумерованные пробирки с сыворотками расставляют в штативе. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и четными номерами – куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой – инактивированный.
В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают взвесь трепонем с активным комплементом до метки 2. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированным комплементом. Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смешивания. (При отсутствии таких колец их можно сделать, разрезав полую резиновую трубку диаметром до 1 см вдоль и соединив концы). Кольца до опыта и каждый раз после его проведения следует кипятить. Во избежание возможного влияния некоторых сортов резины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с температурой плавления выше 50°С (парафин с более низкой температурой плавления непригоден, так как при помещении смесителей в термостат парафин может стечь и герметичность системы будет нарушена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.
