Несса Кэри - Мусорная ДНК. Путешествие в темную материю генома
Пока еще рано делать выводы. Получаемые сегодня данные позволяют дать один совет сторонникам двух этих крайних точек зрения: «Вам не мешало бы немного отдохнуть от споров». Скорее всего, истина где-то посередине. Существует только один по-настоящему надежный способ проверить гипотезу, согласно которой длинные некодирующие РНК выполняют какие-то функции в клетке. Этот способ состоит в том, чтобы проверить каждую из таких РНК в подходящем типе клеток. Подход представляется весьма разумным. Впрочем, он не столь прямолинеен, как может показаться. Отчасти причина этого кроется просто-напросто в цифрах. Если мы возьмемся детектировать сотни или даже тысячи различных длинных некодирующих РНК в клетке или в ткани, придется волей-неволей принимать решения, что же именно анализировать. Но для этого нужно предварительно иметь гипотезу насчет того, что эта конкретная длинная некодирующая РНК делает в клетке. Без такой гипотезы мы не будем знать, какие эффекты нам искать.
Есть и еще одна трудность. Многие из этих длинных некодирующих РНК находятся в той же области, что и «классические» гены, кодирующие белки. Иногда они могут находиться в той же самой позиции, просто на противоположной нити, как мы видели на примерю Xist и Tsix (см. главу 7). Другие такие РНК могут находиться на «мусорных» участках, лежащих между двумя областями одного и того же гена, кодирующими аминокислоты. (Впервые мы встретились с таким явлением, обсуждая атаксию Фридрейха в главе 2.) Существует масса способов расположения длинных некодирующих РНК. Это вызывает существенные экспериментальные затруднения при попытке исследовать функции нуклеотидных последовательностей.
Обычно функции генов проверяются при помощи их целенаправленного мутирования. Можно применять самые разные мутации, но чаще всего используются такие, которые либо выключают изучаемый ген, либо приводят к тому, что уровень его экспрессии начинает превышать норму. Но поскольку такое большое количество длинных некодирующих РНК пространственно перекрываются с генами, кодирующими белки, трудно внести мутацию в одно, не внося при этом мутацию в другое. А значит, перед нами встает очередная проблема: как определить, чем обусловлены наблюдаемые эффекты — изменением в длинной некодирующей РНК или изменением в гене, кодирующем белок?
Вот довольно легкомысленная аналогия. Один аспирант изучал слух лягушек. Он смастерил экспериментальную систему, которая позволяла ему определять, слышит ли лягушка (у которой он хирургическим путем кое-что удалил) громкий звук, в данном случае — пистолетный выстрел. Однажды он прибежал к своей научной руководительнице, радостно крича, что выяснил, как слышат лягушки. «Они слышат лапками!» — объявил он наставнице, которая восприняла эту новость с веселым удивлением. Когда она осведомилась, почему он так в этом уверен, молодой ученый ответил: «Всё просто. Обычно если я стреляю, лягушка слышит этот звук и подпрыгивает от испуга. Но когда я удалил ей лапки, они перестала подпрыгивать, когда я делаю выстрел. А значит, она слышит лапками[21].
Разумеется, теоретически вполне возможно, что некоторые неожиданные эффекты, иногда наблюдаемые при внесении мутаций в гены, кодирующие белки, обусловлены не выявленными нами изменениями в расположенных близ этих генов длинных некодирующих РНК, о присутствии которых мы даже не подозревали, когда проводили эксперимент.
Из-за такого потенциального взаимовлияния длинных некодирующих РНК и генов, кодирующих белки, многие ученые решили сосредоточить усилия на наборе длинных некодирующих РНК, которые не располагаются в этих областях. Выбор здесь велик: в такую категорию попадает как минимум 3500 длинных некодирующих РНК. Многие авторы склонны относить эти «более отдаленные от генов» длинные некодирующие РНК к отдельному классу. Они получили свое наименование[22],12. Впрочем, стоит иметь в виду, что при этом мы классифицируем такие молекулы по тому, что они не делают: они не располагаются в областях, где сидят гены, кодирующие белки. Вероятно, тем самым мы сгребаем большое количество длинных некодирующих РНК в один класс, хотя многие его представители могут сильно отличаться друг от друга по функциям.
Стремление поспешно создавать категории и классификации — давняя проблема в геномном анализе. Ученые ограничивают себя рамками определений, не обретя достаточного понимания биологических процессов. Представьте, что вы никогда в жизни не смотрели кино. И вдруг в течение недели вы увидели «Цилиндр», «Поющих под дождем», «Хорошего, плохого, злого», «Ровно в полдень», «Звуки музыки», «Великолепную семерку», «Кабаре», «Железную хватку», «Непрощенного» и «Вестсайдскую историю». Если вас попросят разбить эти фильмы на категории, вы можете сказать, что они относятся к двум жанрам — мюзиклам и вестернам. Отлично. Но что произойдет на следующей неделе, когда вы познакомитесь с «Дневником Бриджит Джонс» и «Гравитацией»? Или с такими картинами, как «Золото Калифорнии», «Семь невест для семерых братьев» или «Джейн-Катастрофа» — фильмами, где есть и песни с танцами, и ковбои? Вы не сумеете втиснуть эти картины в жанровые определения, которые сами же поспешили создать, еще толком не изучив кинематографического ландшафта. По той же причине не следует создавать чересчур большого количества отдельных классов длинных некодирующих РНК. Лучше сосредоточиться на реальных экспериментальных данных и на том, что они позволяют выяснить.
Хорошее начало жизни — половина дела
Необходимо в течение всей жизни должным образом контролировать экспрессию генов. Такой контроль имеет принципиально важное значение на самых ранних стадиях развития, поскольку малейшее отклонение от нормального течения событий в ходе первых клеточных делений может приводить к серьезнейшим последствиям. Особенно это важно для зиготы — клетки, которая образуется при слиянии яйцеклетки со сперматозоидом. Зиготу и первые клетки, возникающие в результате ее деления, называют тотипотентными клетками. Они способны создавать все клетки эмбриона и плаценты. Исследователи и рады бы работать с этими клетками, но таких клеток слишком мало. Большинство работ выполняется с эмбриональными стволовыми клетками (ЭС-клетками). Много лет назад они произошли от реальных эмбрионов. Но нам больше не нужны эмбрионы, чтобы получать такие клетки: их можно культивировать в лаборатории. ЭС-клетки образуются на чуть более поздней стадии развития эмбриона и уже не обладают такими неограниченными возможностями, как зигота. Их называют плюрипотентными: они обладают потенциалом, позволяющим формировать клетки любого типа, кроме плацентарных.
В правильно подобранных и тщательно контролируемых лабораторных условиях ЭС-клетки делятся, создавая новые плюрипотентные стволовые клетки. Однако сравнительно небольшие изменения условий в культуре приводят к потере этой плюрипотентности. И тогда ЭС-клетки начинают дифференцироваться на более специализированные клеточные типы. Одно из самых резких и заметных изменений происходит, когда ЭС-клетки в процессе дифференциации превращаются в сердечные и вдруг начинают синхронно сокращаться в чашке Петри. Обычно ЭС-клетки могут идти по различным путям развития в зависимости от того, как с ними обращаются.
Ученые манипулировали такими искусственно культивируемыми ЭС-клетками, намеренно прекращая экспрессию примерно 150 из длинных некодирующих РНК, которые расположены вдалеке от каких бы то ни было известных нам генов, кодирующих белки. В ходе каждого эксперимента подавляли экспрессию всего одной длинной некодирующей РНК. Обнаружилось, что в десятках случаев достаточно выключить всего одну длинную некодирующую РНК. чтобы ЭС-клетки утратили плюрипотентность и дифференцировались, давая клетки иных типов. Экспериментаторы проанализировали, какие гены экспрессируются до и после такого подавления длинных некодирующих РНК. Выяснилось, что свыше 90% этих РНК прямо или косвенно контролируют экспрессию генов, кодирующих белки. Во многих случаях отключение одной длинной некодирующей РНК влияло на экспрессию сотен генов, кодирующих белки. Причем почти всегда речь шла о генах, расположенных вдали от подавляемой РНК, а не вблизи.
Те же исследователи провели и обратный эксперимент. Они подвергли ЭС-клетки воздействию вещества, которое (как было известно заранее) вызывает дифференциацию. Затем проанализировали экспрессию в интересующем их классе длинных некодирующих РНК. Выяснилось, что экспрессия примерно 75% этих РНК падала по мере того, как клетки утрачивали плюрипотентность и проявляли готовность к дифференциации. Эти два набора данных вполне согласуются с гипотезой, в которой утверждается, что уровни экспрессии определенных длинных некодирующих РНК действуют как «сторожа», поддерживающие ЭС-клетки в плюрипотентном состоянии13. Похоже, эти некодирующие РНК все-таки выполняют в клетке какую-то функцию — по крайней мере, на ранних стадиях развития организма.
