Мир до нас: Новый взгляд на происхождение человека - Том Хайэм
К счастью, за последние годы все заметно изменилось в лучшую сторону. Ученые разработали потрясающие способы устранения загрязняющих веществ и фрагментов ДНК, полученных от других организмов, таких как микробы и бактерии, и выделения для анализа только эндогенной, или исходной, ДНК. Особое внимание уделяется обеспечению чистой среды в процессе извлечения ДНК. В лабораторных помещениях создают повышенное давление, чтобы, когда открывается дверь, наружный воздух ни в коем случае не попадал внутрь. Ученые также носят в лаборатории защитную одежду, чтобы гарантированно избежать загрязнения образцов костей и зубов своей собственной ДНК. При посещении чистой лаборатории необходимо не только использовать одноразовые бахилы или тапочки, предназначенные лишь для данного помещения, но и облачаться в средства индивидуальной защиты для всего тела. Наши тела щедро рассыпают частицы, содержащие ДНК, и крайне важно не допустить их попадания на предметы исследования. Едва ли не параноидальное отношение нескольких исследовательских центров – для нашей истории существенно, что к их числу относятся и лаборатории Института Макса Планка в Лейпциге, – к борьбе со всепроникающим загрязнением является одним из ключевых факторов, обеспечивающих нам сегодня возможность извлечь достоверно подлинную ДНК древнего человека.
Генетики также разработали методику извлечения ДНК с признаками «повреждения» или химического изменения, приобретенными с течением времени и говорящими о том, что она имеет древнее происхождение, а не получена из современных, загрязняющих источников.
Чтобы понять, зачем нужна борьба за чистоту при извлечении генетического материала и как осуществляется это извлечение, необходимо уяснить, что, собственно, представляет собой ДНК. Молекула ДНК похожа на закрученную вокруг воображаемой вертикальной оси веревочную лестницу. Сами веревки образованы чередующимися друг с другом молекулами дезоксирибозы и фосфатной группы. Ступеньки-поперечины формируются из так называемых оснований ДНК, или нуклеотидов: аденина (А), всегда находящегося в паре с тимином (Т), и гуанина (Г) – с цитозином (Ц). Со временем некоторые части ступенек претерпевают химические изменения. Нуклеотид цитозин, например, может превратиться в урацил, который при репликации ДНК связывается не с гуанином, а с аденином. Очень важно, что частота нахождения молекул урацила в ДНК тесно коррелирует с возрастом: чем древнее кость, тем больше в ней обнаруживается вкраплений урацила. При секвенировании ДНК в лаборатории фермент, используемый для расшифровки последовательности, будет указывать на привязку А к Т, а не к Г, с которым всегда связан цитозин{100}. Таким образом, Ц, словно по волшебству, превратится в Т. Эта замена Ц на Т приводит к повышенному содержанию Т на концах каждой лесенки ДНК. У непосвященных это может вызвать недоумение, но важно знать, что такая диспропорция указывает на высокую вероятность истинной древности цепочек ДНК и, как следствие, отсутствие в них загрязнений со стороны современной ДНК. Генетики способны физически отделять в лаборатории молекулы ДНК с высоким содержанием урацила, являющиеся, как им известно, древними, от загрязненных{101}.
Кроме того, древние молекулы ДНК с гораздо большей вероятностью будут состоять из коротких цепочек парных нуклеотидов, нежели из очень длинных. Дело в том, что более длинные цепочки оснований, как правило, относятся к современной ДНК и, следовательно, должны восприниматься как загрязнители, тогда как более короткие последовательности стали такими естественным путем из-за возраста и распада. Ученые знают это и, прежде чем приступить к анализу, стараются устранить длинные загрязняющие цепочки ДНК.
Для удаления загрязняющих веществ и повышения концентрации исходной (эндогенной) ДНК используются и другие химические методы, в том числе с применением химических очищающих средств, такие как отбеливание костей перед экстракцией ДНК{102}. Благодаря этому и другим достижениям науки мы, примерно с 2003 г., можем извлекать из человеческих костей бесспорно древние последовательности ДНК. (Здесь же я должен сообщить, что те из моих коллег, кто ранее был настроен скептически, очень рады тому, что оказались неправы.)
Другим крупным успехом древней геномики стала разработка мощных инструментов секвенирования, которые позволяют надежно секвенировать генетический код чуть ли не на промышленной основе.
В 1990-х гг. ученые преимущественно использовали метод ПЦР – полимеразной цепной реакции. Он не потерял своей значимости и сегодня; так, ПЦР широко применялась для выявления вирусной РНК в ходе исследований, связанных с началом пандемии Covid-19 в 2020 г. Этот метод основан на копировании маленьких фрагментов ДНК с использованием фермента полимеразы и их амплификации – многократного точного воспроизведения, что облегчает их исследование. Метод ПЦР оказался поистине революционным, и его автор Кэри Муллис заслуженно получил в 1993 г. Нобелевскую премию по химии{103}. Метод дает нам возможность добывать путем амплификации огромное количество пригодной для исследования ДНК. Исходный фрагмент ДНК используется полимеразой как шаблон для синтеза все новых и новых копий. Копия остроумно строится из новых нуклеотидов (оснований), которые связаны друг с другом полимеразой, начиная с так называемых праймеров – отдельных коротких отрезков ДНК (около 20 оснований), которые присоединяются к концу одной из частей фрагмента древней ДНК. Полимераза играет примерно ту же роль, что и застежка-молния, – собирает созданные, так сказать, в пробирке одиночные свободные основания-дезоксинуклеотиды и химически привязывает их к фрагментам ДНК одно за другим, в должном порядке, многократно увеличивая количество исходной ДНК.
На этом рассказ об амплификации можно завершить. Теперь о другом: как не только извлечь хорошо знакомую нам последовательность нуклеотидов – А, Т, Ц, Г (аденин-тимин и цитозин-гуанин), уникальный код ДНК, который формирует двойную спираль, также известную как древо жизни, – но и узнать, что же она означает? Чтобы разобраться в этом, необходимо сперва понять, что такое секвенирование, а для этого нужно вернуться в 1977 г., к разработке первой технологии геномного секвенирования нобелевским лауреатом Фредериком Сэнгером[24].
Точно выстроить буквенную последовательность ДНК удается благодаря весьма находчивому методу прекращения ПЦР на том самом основании, которое нужно прочитать. Для приостановки реакции добавляются дезоксинуклеотиды другого типа, не способные образовать химическую связь со следующим основанием в последовательности, – так называемые дидезоксинуклеотиды, или ддНТФ.
Рис. 12. Схема полимеразной цепной реакции
Фрагменты амплифицированной ДНК поровну распределяются по четырем колбам, в каждой из которых содержатся дезоксинуклеотиды, включающие в себя одно из оснований: аденин, тимин, гуанин или цитозин. Затем в каждую колбу добавляется определенный ддНТФ, или нуклеотид-терминатор. Итак, в первой колбе содержится только ддНТФ, помеченный аденином, во второй – цитозином и т. д. Таким образом, в первой колбе репликация ДНК продолжится до тех пор, пока реакция не остановится в точке, где к последовательности этого фрагмента ДНК добавляется меченный конкретным основанием ддНТФ. Вы получите четыре колбы, содержащие фрагменты ДНК переменной длины, которые оканчиваются на определенном основании: аденине, тимине, гуанине или цитозине.
Теперь, чтобы выяснить, какую позицию занимают эти основания в общей последовательности ДНК, необходимо количественно определить размеры каждого фрагмента, для чего служит следующая часть сэнгеровского процесса – электрофорез. Это слово всего-навсего означает движение различных частиц под действием постоянного электрического тока в жидкости – в нашем случае, в полиакриламидном геле. Содержимое каждой из четырех колб выливают в четыре отделения с гелем и включают ток. В каждом из отделений фрагменты ДНК перемещаются от отрицательного полюса к положительному. Чем меньше и легче фрагменты, тем дальше они продвигаются, образуя при остановке видимые полосы. В первой емкости будут находиться фрагменты, движение которых прервалось на А, во второй – на Ц, в третьей – на Г и в четвертой – на Т. После завершения опыта последовательность оснований можно прочитать снизу вверх в порядке увеличения массы фрагментов, а затем расположить в правильной очередности согласно известной парности нуклеотидов. Таким образом мы получаем последовательность ДНК – АГТТЦАГЦАТАГА и т. д. Этот метод был использован для создания человеческого генома в амбициозном проекте «Геном человека», который продлился 10 лет и обошелся его спонсорам в 3 млрд долларов.
Рис. 13. Схема секвенирования по Сэнгеру
ПЦР – безусловно, гениальное изобретение – все же имеет определенные недостатки, в частности касающиеся древней ДНК. Загрязняющая ДНК подвергается амплификации с тем же успехом, что и древняя; так удобрения, которые вы
