Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3 - Журнал «Домашняя лаборатория»
Рис. 97.Разделение смеси полидеоксиаденозииа (pd (А) 40–60) с олигонуклеотидами в капилляре, заполненном гелем 12 % Т, 0 % С.
Условия разделения: L=30/37 см, Е=300 В/см; буфер: 0.1 М ТВЕ, 7 М мочевина, pH 8.3.
Эти гели находят применение также в определении последовательности нуклеотидов в ДНК, причем для детектирования в данном случае применяют лазерноиндуцируемую флуоресценцию. Гели непроницаемы для УФ-лучей с длиной волны меньше 250 нм. Кроме того, поскольку в распоряжении имеются очень малые пробы, в данном случае требуется очень высокая чувствительность детектора. Граница определения в данном случае составляет примерно 10-11 М.
12.1.3. Полиакриламидный гелевый электрофорез белков с ДДСН
КГЭ применялся почти исключительно для разделения молекул ДНК, поскольку чувствительное определение белков в гельзаполненных капиллярах невозможно из-за поглощения самого полиакриламида в области относительно коротких УФ-лучей (<250 нм). Взаимодействия белков с гелями также могут играть определенную роль, так что до настоящего времени в гельзаполненных капиллярах описано только успешное разделение белков, денатурированных ДДСН.
Обычно белки соответственно своим значениям р1 обладают различным зарядом молекул, на этом основано их разделение при применении нормальных буферных систем в условиях, исключающих денатурацию. Для достижения разделения по ММ белки должны обладать одинаковым отношением заряда к поверхности. В этом случае возможно разделение в геле по молекулярным размерам или ММ.
Белки полностью денатурируются в избытке ДДСН и 2-меркаптоэтанола (разрушение бисульфидных мостиков). Возникающие цепочки полипептидов связывают независимо от своих размеров и структуры постоянное количество ДДСН (1,4 г ДДСН/1 г белка). Поскольку ДДСН гасит заряды белково-детергентных комплексов, все белки, обработанные таким способом, будут иметь одинаковые соотношения зарядов на единицу массы. Из этого следует, что подвижность в буферной среде без "ситовых свойств" будет однородна. Если использовать теперь гель, то измеряемая подвижность анализируемых веществ будет пропорциональна эффективным ионным радиусам и, следовательно, ММ этих веществ (цепочек полипептидов). Из линейной зависимости между логарифмом ММ и временем миграции можно определить ММ белка. На рис. 98 показано разделение ДДСН белкового стандарта с высокой ММ.
Рис. 98. Разделение белков большой ММ в поперечносшитом полиакриламидным геле.
Условия разделения: L=20 см (эффективная), Е=180 В/см, буфер: 0.12 М Трис, 0.12 М гистидин, pH 8.8, 0.1 МДЦСН, 1 % 2-пропанол, 5 % Т, 1 % С, полиакриламид. Проба: 1 — овальбумин, 2 — альбумин крупного рогатого скота, 3 — бета-галактозидаза, 4 — миозин.
Таким образом, полиакриламидный гелевый электрофорез с ДДСН представляет собой метод, альтернативный методу ИЭФ и применяется также в классическом 20-электрофорезе (ИЭФ, совмещенный с ДДСН-ПААГ-электрофорезом) в качестве высокоразрешающего способа разделения.
12.2. Гели на основе пописахаридов и других полимеров
В КГЭ в качестве разделяющей среды наряду с полиакриламидными гелями применяют ряд других водорастворимых полимеров. В таблице 30 приведены используемые до настоящего времени полимеры и основные области их применения.
Основным преимуществом этих разделительных матриц является их УФ-проницаемость в области длин волн ниже 260 нм. Низкая токсичность этих полимеров по сравнению с мономером акриламидом упрощает работу с этими растворами и их хранение. К тому же эти полимеры при применяемых концентрациях менее вязки, так что может проводиться их замена после каждого анализа. Однако, для некоторых длин ДНК они дают меньшую разрешающую способность, чем акриламидные гели. Эти гели очень выгодно применять для разделения ДДСН-белковых комплексов, т. к. в данном случае их можно детектировать с большой чувствительностью при относительно коротких длинах волн (214 нм). В этом случае следует дополнительно оптимизировать выбор некоторых буферных сред, не поглощающих в УФ-области На рис. 99 представлено разделение стандартного ДДСН-белкового комплекса в растворе декстрана, прозрачном по отношению к УФ-лучам. Три разделения показывают воспроизводимость при замене полимерных растворов в капилляре.
Рис. 99. Разделение ДДСН-белковых комплексов и стабильность капилляра при замене декстранового полимерного раствора.
Условия разделения: L=30 см (эффективная), Е=300 В/см, буфер: 0.06 М 2-амино-2метил=1-3-пропандиод/какодидовая кислота, pH 8.8, 0.1 % ДДСН, об. 10 %) декстраи (ММ 2000000), детектирование: 214 им.
Различия между этими полимерными матрицами заключаются в основном в пористой структуре. Размеры пор и упругость встроенных в гель полимерных цепочек оказывают значительное влияние на работоспособность при разделении по молекулярным размерам. На рис. 100 представлена структура агарозного геля и ее формирование из мономерных волокон (слева). Гидроксиэтилагароза (рис. 100, справа) обладает сильно измененной структурой. Образование сдвоенной структуры приводит к сужению пор, и такой гель лучше применять для биополимеров с меньшими размерами.
Рис. 100. Формирование агарозного геля и образование сдвоенной структуры. Слева — регулярная агароза, справа — гидрокси-этилагароза.
12.3. Модели миграции биополимеров в полимерных растворах
Поскольку подвижности молекул ДНК различных размеров в свободных растворах из-за одинаковых соотношений поверхность/заряд не различаются, разделение по молекулярным размерам может не достигаться. Это делает необходимым применять среду с ситовыми свойствами. Ситовые свойства в простейшем смысле описываются взаимодействиями молекул анализируемых веществ с волокнами разделяющего полимера (геля).
В зависимости от размеров пор и длин биополимеров между полимерными волокнами имеют место различные конформации анализируемых веществ. Эти конформации отвечают за различные подвижности и возникающие нерегулярности.
Ясно, что молекулы в компактной или разреженной конформациях обладают подвижностью, отличной, например, от подвижности молекул вытянутой формы. Конформации можно наблюдать с помощью лазерной флуоресцентной микроскопии.
Для различных взаимодействий молекул ДНК обсуждаются различные механизмы разделения. Сила взаимодействия с полимерной матрицей больше для больших молекул ДНК, на этом и основано разделение по молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров молекул анализируемых веществ (биополимеров), а также от пористой структуры полимерного раствора (геля) можно придти к различным механизмам разделения. Как правило, для подвижности анализируемых веществ в разделяющем полимере находят зависимость от размеров молекул анализируемых веществ. Такая зависимость показана на рис. 101.
Рис. 101. Зависимость логарифма подвижности анализируемых веществ от логарифма длины сегментов этих веществ при постоянном размере пор разделяющей матрицы.
Здесь можно выделить 4 области:
A) В начальной области кривой подвижность изменяется слабо с ростом длины анализируемых веществ, т. е. для маленьких фрагментов селективность невысока. В этой области, называемой областью Огстона, размеры пор геля больше, чем размеры самих молекул, которые без заметного сопротивления проходят через гель. При этом молекулы могут сохранять свою глобулярную структуру. Это является причиной низкой селективности в данной области размеров молекул анализируемых веществ.
B) В так называемой области рептации имеет место большое изменение подвижности анализируемых веществ с ростом длины их цепочек и, тем самым, высокая
