Максим Франк-Каменецкий - Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века
Вирус осповакцины оказался уникальной находкой для эпидемиологов. Он практически безвреден для человека, очень эффективен при иммунизации и легко размножается при заражении им коров. Все это позволило Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) провести широкую многолетнюю кампанию по борьбе с оспой, которая увенчалась блестящим успехом. В 1977 году ВОЗ объявила, что этой болезни, которая еще недавно уносила миллионы жизней, на Земле больше нет.
Б. Мосс и его сотрудники из Национального института здравоохранения (США) решили, используя методы генной инженерии, изменить вирус осповакцины таким образом, чтобы вакцинация защищала не только от оспы, но и от гепатита. Они встроили ген поверхностного белка вируса гепатита в ДНК вируса осповакцины, снабдив его эффективным промотором. Опыты на кроликах показали, что белок гепатита вырабатывается при вакцинации таким вирусом, причем в ответ на выработку этого белка в крови появляется множество антител против вируса гепатита.
Метод Мосса позволяет создавать вакцины против разных вирусных заболеваний животных и человека на основе вируса осповакцины путем встраивания в ДНК вируса генов соответствующих поверхностных белков. Это очень многообещающее направление генно-инженерной эпидемиологии развивается весьма успешно в разных странах. При этом не надо заново учить медперсонал – ему приходится иметь дело с хорошо знакомым вирусом осповакцины. А если будет реализована идея Мосса, одним махом удается убить сразу нескольких зайцев, т. е. покончить одновременно с несколькими вирусными болезнями.
Технология редактирования генома
Как я уже много раз отмечал, решающим событием, приведшем к рождению генной инженерии и вообще современной биотехнологической индустрии, было открытие ферментов рестриктаз. Рестриктазы узнают специальные последовательности в двуспиральной ДНК и наносят двунитевой разрыв в совершенно определенном месте (см. главу 4). Но рестриктазы узнают короткие последовательности, в основном состоящие всего из шести нуклеотидов, так что каждая конкретная рестриктаза нарезает геномную ДНК на множество фрагментов. Такой инструмент не годится для редактирования генома, т. е. для локального изменения текста, которое не затрагивало бы другие участки. Для этого нужен инструмент, способный с хирургической точностью сделать во всей геномной ДНК человека один разрыв.
Давайте оценим, последовательность какой длины такой инструмент должен узнавать. Будем считать для простоты, что геномная ДНК представляет собой чисто случайную последовательность четырех нуклеотидов А, Т, Г, Ц, причем все четыре нуклеотида встречаются с одинаковой вероятностью (это, конечно, грубое предположение, но для приблизительной оценки вполне годится). Тогда вероятность встретить конкретную последовательность из n нуклеотидов будет, очевидно, 4—n. Такая последовательность встретится в геноме, состоящем из N нуклеотидов, N 4—n раз. Следовательно, чтобы последовательность встретилась всего один раз, нужно, чтобы выполнялось условие: N 4—n = 1. Из этого уравнения легко находим: n = logN / log4 – и, вспомнив, что человеческий геном состоит из 3109 нуклеотидов, получаем для n значение 16. Таким образом, для того, чтобы последовательность не повторялась в геноме, т. е. была уникальной, она должна состоять не менее чем из 16 нуклеотидов. Теперь мы видим, насколько рестриктазы – негодный инструмент для редактирования генома.
Химики, биохимики и биофизики взялись за поиск адекватного инструмента, в частности, автор этих строк приложил большие усилия в этом направлении. Первой идеей было использовать способность ДНК образовывать тройную спираль, о чем мы уже говорили в главе 9. Идея казалась очень привлекательной. Достаточно выбрать целевую последовательность в геноме из, скажем, 16 нуклеотидов и синтезировать соответствующую цепь однонитевой ДНК из 16 нуклеотидов, которая образовывала бы с выбранным участком геномной ДНК тройную спираль. На один из концов синтетической ДНК можно приладить активную химическую группу или даже целый белок-эндонуклеазу, способный разрезать ДНК там, куда он доставлен. Но проблема с триплексами в том, что они образуются только в тех местах генома, в которых в одной цепи стоят одни пурины (А и Г), а, соответственно, в комплементарной цепи одни пиримидины (Т и Ц). Такие участки длиной в 16 или более нуклеотидов редко встречаются в геноме, что резко сужает выбор целевых участков для разрезания. Так что от ДНКовых триплексов пришлось отказаться.
Следующей идеей было использовать синтетический аналог ДНК, ПНК, или пептидную нуклеиновую кислоту. Этот очень интересный синтетический аналог ДНК был изобретен в 1991 году в группе Питера Нильсена в университете Копенгагена. ПНК имеет те же основания, что и ДНК, но вместо сахарофосфатного остова основания присоединены к пептидному остову, похожему на остов белковой цепи (рис. 45). Поскольку, в отличие от ДНК, ПНК не несет отрицательного заряда, две молекулы ПНК образуют с одиночной цепью ДНК очень прочные триплексы. Эти триплексы настолько прочные, что две молекулы ПНК в определенных условиях способны раскрыть двойную спираль, образовав триплекс с одной из цепей, оставив комплементарную цепь без партнера (рис. 45). У ПНК множество применений, но нас сейчас интересует одно из них, состоящее в превращении обычных рестриктаз, узнающих последовательности из шести нуклеотидов, в инструмент с гораздо большей избирательностью. Как это делается, схематически показано на рис. 45.
Рис. 45. ПНК имеет те же основания, что и ДНК (обозначены как В), но они прикреплены к совсем другому остову, чем в ДНК, напоминающему остов молекулы белка. Так называемая бис-ПНК, состоящая из двух коротких молекул ПНК, связанных гибкой молекулярной связкой, образует триплекс с одной из цепей ДНК (посредством триад, изображенных на рис. 42), оставляя комплементарную цепь в виде однонитевой петли. В нижней части рисунка дана схема того, как бис-ПНК используется для того, чтобы превратить обычную рестриктазу в очень редко расщепляющий ДНК инструмент
Целевой участок в геноме для связывания двух молекул ПНК с образованием триплекса выбирается таким образом, чтобы он чуть-чуть перекрывался с участком связывания какой-нибудь рестриктазы. После связывания ПНК с ДНК препарат обрабатывается соответствующей рестриктазе метилазой. Метилаза метилирует все участки узнавания в геноме, кроме одного, который стал недоступен для связывания метилазы, так как его дуплексная структура была нарушена связыванием ПНК. Затем делается так, чтобы связывание ПНК с ДНК было разрушено. В результате единственное место связывания рестриктазы с ДНК восстанавливается, тогда как все остальные места связывания не работают, поскольку они прометилированы. Теперь рестриктаза разрежет ДНК только в одном месте, в том, которое было изначально выбрано для этой цели. Конечно, мы несколько утрировали ситуацию, неметилированных участков в геноме может оказаться несколько, но ясно, что такой подход должен резко увеличивать избирательность нуклеаз, что и было экспериментально продемонстрировано в моей лаборатории в Бостонском университете в работе, выполненной совместно с Нильсеном.
Все же подход, основанный на ПНК, оказался слишком сложным, и, что самое главное, его не удавалось использовать в живой клетке. А именно редактирование ДНК непосредственно в живой клетке представляет наибольший интерес. К началу 2010 года два очень изощренных биохимические метода специфического разрезания ДНК были разработаны в биотехнологических компаниях. И их уже стали применять для редактирования геномов. Но в начале 2013 года произошел подлинный прорыв, который самым радикальным образом изменил ситуацию. Появился метод, носящий неуклюжее название КРИСПР-кас.
Метод целиком базируется на системе приобретенного иммунитета у бактерий, о котором рассказано в главе 6.
Для редактирования генома действующие лица иммунной защиты бактерий, крРНК и кас-белок, переносят в эукариотическую клетку, при этом дизайн молекулы крРНК делается с таким расчетом, чтобы промежуточная последовательность в ней была идентична выбранному участку в геномной ДНК эукариотической клетки. «Как это можно?! – слышу изумленный возглас читателя. – Система произведет двунитевой разрыв в ДНК, на этом все и закончится: клетка погибнет». Нет, не закончится. Ведь недаром мы диплоидные существа: у каждого участка нашей аутосомной ДНК есть двойник, гомологичный участок, расположенный на сестринской хромосоме. Наличие гомологичного участка позволяет нашим соматическим клеткам залечивать или, как говорят, репарировать ДНК, которая подверглась самому опасному повреждению: двунитевому разрыву. Этот механизм репарации двунитевых разрывов называется гомологичной рекомбинацией. В деталях гомологичная рекомбинация – это сложный процесс, и он происходит не только при репарации, но и в других случаях.
