Станислав Галактионов - Биологически активные
Обо всем этом прямо объявлялось во введении, и, казалось бы, всякий здравомыслящий человек должен был бы после этого отложить сочинение доктора Лаговского в сторону. Возможно, кое-кто из читателей так и поступил; однако те, что дочитали его до конца, не без удивления обнаружили, что картина китайской жизни того периода, воссозданная автором на основании весьма немногих (по его мнению, надежных) фактов, представляется в высшей степени убедительной. Воистину, с помощью одних только рассуждений можно проникнуть за любой «информационный занавес» очень глубоко, даже в столь сложном вопросе, как тот, за изучение которого взялся Б. Лаговский.
Ну а что уж говорить о вещах намного проще – рецепторах, биорегуляторах?
Молекула биорегулятора связывается с рецептором за счет невалентных взаимодействий – электростатических, гидрофобных и т.п., о них уже шла речь выше. Благодаря точному взаимному соответствию формы, «правильной» ориентации заряженных групп, полярных и неполярных частей молекулы комплекс биорегулятора со специфическим рецептором оказывается довольно прочным, но все же несравнимым по стабильности со структурой, которая возникла бы при их соединении валентной связью. Энергия образования даже наиболее прочных из известных гормон-рецепторных комплексов составляет несколько более одной десятой энергии образования, скажем, валентной связи –O–H. Образовавшиеся комплексы под действием тепловых толчков через некоторое время распадаются; среднее время их существования для разных биорегуляторов составляет от нескольких сотых секунды до секунды.
Речь идет, таким образом, о динамическом процессе. Скорость образования комплексов, как и при любой реакции второго порядка, пропорциональна произведению концентрации свободных рецепторов и биорегулятора, скорость распада – пропорциональна количеству комплексов. По мере образования новых комплексов (а следовательно, и увеличению скорости их распада) количество свободных рецепторов убывает: скорость образования комплексов снижается. При достижении некоторой величины количество существующих комплексов остается неизменным – наступает динамическое равновесие, то есть скорости их образования и распада уравниваются.
Многим читателям, возможно, знакома игра, популярная еще до появления всяких кубиков Рубика и змеек. В плоской коробочке с прозрачной крышкой находятся разноцветные шарики; в дне коробочки есть лунки. Задача заключается в размещении шариков в лунках в определенном порядке. Если принять, что дно – это поверхность мембраны клетки-мишени, то лунки – рецепторы, а шарики – молекулы гормона. Мы воспользуемся этим устройством для моделирования процесса образования гормон-рецепторных комплексов.
Вначале шарики брошены как попало, часть из них закатилась в лунки, остальные – нет (по условиям нашего мысленного эксперимента шариков намного больше, чем лунок – в отличие от реальной игры, где число тех и других равное). Начнем теперь слегка встряхивать коробочку. Этим мы, ясное дело, моделируем тепловые эффекты; шарики придут в движение. Те из них, которые находятся вне лунок, в результате случайных перемещений рано или поздно закатятся в свободную лунку (размеры лунок таковы, что туда помещается только один шарик), так что в конце концов все лунки могут оказаться занятыми. Правда, произойдет это, только если толчки, вызываемые потряхиванием, слишком слабы для того, чтобы выкатить из лунки уже находящийся там шарик. Если же встряхивать посильнее, некоторые шарики начнут выскакивать из лунок; правда, освободившиеся лунки тут же займут другие шарики, но тем временем выкатятся шарики из других лунок, так что какая-то их часть будет постоянно свободна. Очевидно, эта доля будет тем меньше, чем глубже лунки (большая энергия связывания молекулы гормона с рецептором), чем больше шариков находится в коробке (выше концентрация гормона) ну и, конечно, чем слабее мы встряхиваем коробку (ниже температура).
Для определения эффективности связывания рецептором молекулы гормона наряду с энергией взаимодействия можно воспользоваться константой диссоциации комплекса – это взаимосвязанные величины. Говоря о «концентрации» шариков в коробке, мы имеем в виду поверхностную концентрацию: их количество, приходящееся на единицу площади дна коробки. Нам совершенно безразлично, будет ли это квадратный дециметр, сантиметр, дюйм и т.п.; выберем в качестве такой единицы величину площади дна коробки, приходящуюся на один имеющийся в нем шарик – S, так чтобы концентрация шариков равнялась 1/S. Тогда упомянутая константа диссоциации будет равна отношению свободных и занятых лунок. Эта константа сама имеет размерность концентрации и должна, очевидно, также выражаться в выдуманных нами единицах штук /S. Энергия образования комплекса пропорциональна логарифму константы диссоциации, причем коэффициент пропорциональности отрицательный: чем больше энергия, тем меньше константа диссоциации. Такой характер связи этих двух величин определяют законы статистической физики, от более подробных пояснений я предпочту воздержаться.
На языке физической химии
«Химик работает плохими методами с хорошими веществами, физик – хорошими методами с плохими веществами, физический химик – плохими методами с плохими веществами». Это изречение, известное всем читателям сборника «Физики шутят», никакого, естественно, отношения не имеет к исследованиям, в которых методы физической химии – теоретические и экспериментальные – использовались для изучения взаимодействия биорегуляторов с их рецепторами.
Для экспериментального изучения процесса связывания биорегулятора с рецепторами обычно применяют изотопную технику. Сперва нужно получить радиоактивный, «меченый» препарат биорегулятора. Если речь идет о соединении сложной структуры, например, белке, прибегают к обработке выделенного из природных материалов препарата радиоактивным реагентом, взаимодействующим с определенными его функциональными группами. Например, гидроксильные группы остатков тирозина в пептидах и белках легко модифицировать с помощью некоторых соединений йода. Очевидно, это будет не просто йод, а его радиоактивный изотоп 125I. Этот метод сравнительно прост, но не лишен недостатков. Та же гидроксильная группа тирозина может выполнять определенную роль в активации рецептора, да и введение громоздкого атома йода изменяет пространственное соответствие рецептору. Гораздо надежнее попытаться «встроить» радиоактивный изотоп непосредственно в молекулу биорегулятора вместо обычного стабильного. Наиболее удобен для этой цели тритий уж атомы-то водорода входят в состав молекул решительно всех известных биорегуляторов.
Словом, так или иначе радиоактивный аналог можно получить, в конце концов, это лишь вопрос техники.
Теперь необходимо приготовить препарат ткани органа-мишени, содержащей соответствующие рецепторы. Это может быть кора надпочечников, печень, гипоталамус и т.п. В простейшем случае используют просто тонкие срезы тканей, но чаще ткань очень тонко измельчают, а полученные частички разделяют по величине с помощью особых приемов центрифугирования на несколько фракций. Частички эти называют микросомами, что часто ведет к путанице, поскольку так же называется и определенный вид субклеточных образований (органелл). Наш брат естественник любит иногда прервать дискуссию репликой: «Позвольте, мы же спорим о словах», и звучит это неизменно чуть-чуть презрительно, не без основания, может быть. Но, с другой стороны, и терминологическая распущенность должна иметь границы.
В некоторых фракциях и сосредоточены рецепторсодержащие структуры. Как узнать, в которых именно? Совершенно очевидно – это как раз те фракции, которые более всего связывают меченый препарат!
Как определить количество связанного препарата? Казалось бы, очень просто: помещаем микросомы в раствор меченого биорегулятора, выдерживаем там какое-то время, отделяем, например, центрифугированием и определяем их радиоактивность.
На самом деле приходится прибегать к более сложной процедуре. Часть препарата под действием ферментов, присутствующих в микросомах, разрушится, а образовавшиеся радиоактивные осколки могут сорбироваться на микросомах; некоторое количество меченого биорегулятора диффундирует в глубь частиц и т.п. Чтобы учесть только обратимое связывание поверхностными центрами, микросомы, выдерживаемые в растворе радиоактивного вещества («проинкубированные», если пользоваться профессиональным жаргоном), отделяют и помещают в более концентрированный раствор нерадиоактивного препарата. По прошествии некоторого времени меченый биорегулятор, сорбированный на поверхности микросом, «вытесняется», заменяется нерадиоактивным и, поскольку концентрация последнего намного больше, практически весь переходит в раствор. Опять микросомы отделяют и по радиоактивности раствора определяют количество обратимо связавшегося препарата.
