Рудольф Рэфф - Эмбрионы, гены и эволюция
Локальные переключатели генов
Однажды знаменитого альпиниста Джорджа Маллори спросили, почему ему хотелось взобраться на Эверест. Он ответил: «Потому что Эверест существует». По-видимому, по такому же принципу в природе происходит выбор точек, которые контролируют биологические процессы. Поскольку регуляция генной экспрессии на уровне сплайсинга наблюдается так часто, возникает соблазн предположить, что у эукариот вся регуляция осуществляется на уровне сращивания ядерных транскриптов. Однако экспрессия многих генов, в частности тех, которые кодируют белки, характерные для клеток с терминальной дифференцировкой, регулируется на уровне транскрипции. Прекрасной иллюстрацией этого служит синтез овальбумина, индуцируемый в яичниках эстрогеном. Руп и др. (Roop et al.), используя меченную изотопами клонированную овальбуминовую ДНК в качестве пробы на транскрипты овальбуминовых генов в ядрах клеток яичников, обнаружили в ткани, стимулированной эстрогеном, примерно по 3000 транскриптов на ядро, а в тканях цыплят, не получивших гормона, - менее 2 на ядро. В подобных легко поддающихся изучению случаях участвуют гены, продуцирующие в ответ на индуцирующий сигнал очень большие количества какого-либо специализированного продукта. Вполне возможно, однако, что экспрессия генов, ответственных за важнейшие решения в процессе развития, также регулируется на уровне транскрипции. На такую мысль наводит поведение при транскрипции пуф - областей в политенных хромосомах, в которых дифференцировка явно связана с дифференциальным характером транскрипции. На это указывают также сроки проявления активности генов, играющих важную роль в развитии. Цитоплазма неоплодотворенных яиц содержит очень разнообразные мРНК, а между тем преобладающее большинство мутаций, наблюдаемых в экспериментах, подобных описанным в гл. 10, проявляются у зародыша, а не передаются по материнскому типу. Очевидно, что активность соответствующих генов приходится на эмбриональный период.
В регуляции генной экспрессии, по-видимому, участвуют локальные регуляторные элементы, либо примыкающие к отдельным генам, либо находящиеся в них самих. Транскрипционные единицы содержат не только кодирующие последовательности и интроны, но также некодирующие последовательности, примыкающие к генам на 5'- и 3'-концах. Существование регуляции на уровне и транскрипции, и процессинга свидетельствует о том, что локальные регуляторные элементы включены в транскрипционные единицы. Некоторые из первичных локальных регуляторных элементов представлены сайтами, которые должны распознавать поступающие извне регуляторные сигналы, специфически индуцирующие или репрессирующие транскрипцию данного гена. В их число входят также: сайт для связывания РНК-полимеразы, сайт, инициирующий транскрипцию; сайт, определяющий окончание транскрипции; сайты, определяющие процессинг; сайты, в которых происходит разрезание и сращивание при процессинге, и сайты внутри самой мРНК, обеспечивающие ее присоединение к рибосоме и начало трансляции.
Существование функционального локального контролирующего элемента, примыкающего к гену, показали генетическими методами Човник (Chovnick) и его сотрудники для локуса rosy у дрозофилы. Локус rosy был первоначально определен как локус, в котором возникает рецессивная мутация, обусловливающая коричневатый цвет глаз. Эта мутантная окраска вызвана недостатком дрозоптерина - пигмента, обусловливающего красный цвет глаз; недостаток пигмента создается отсутствием фермента ксантиндегидрогеназы. Мутации в локусе rosy вызывают структурные изменения белка ксантиндегидрогеназы. Човник и его сотрудники определили протяженность гена ксантиндегидрогеназы, составив карту внутригенных рекомбинаций очень большого числа мутаций в локусе rosy. Существуют также генные изменения, оказывающие влияние на уровень экспрессии этого гена. Одно из них было нанесено на карту как предположительный прилегающий регуляторный элемент, активный в цис-положении. Было установлено, что этот мутантный вариант продуцирует большее количество ксантиндегидрогеназы, чем обычно, и что продуцируемый белок отличается по электрофоретической подвижности. Как показал анализ внутригенных рекомбинантов, регуляторный сайт отделен от «электрофоретического» сайта, находящегося в самом структурном гене ксантиндегидрогеназы. На генетической карте регуляторный сайт лежит на расстоянии, соответствующем 3000 пар нуклеотидов, от одной из границ структурного гена, установленной генетическими методами. Хотя этот мутантный сайт, казалось бы, расположен очень далеко от структурного гена ксантиндегидрогеназы, возможно, что на самом деле сайт инициации транскрипции находится не так уже далеко от мутантного регуляторного сайта. Вполне возможно, что сайт инициации транскрипции по аналогии с ситуацией для генов белков хориона, схематически представленной на рис. 10-7, находится вблизи от регуляторного сайта и отделен от структурного гена, определенного генетическими методами, большим нитроном.
Создание методов клонирования рекомбинантной ДНК и секвенирования ДНК сделало возможным (и модным) поиск локальных регуляторных сайтов в последовательностях ДНК, примыкающих к структурным генам.
Было обнаружено некоторое число потенциальных регуляторных сайтов. Они схематически изображены на рис. 11-7, ни котором показана идеализированная транскрипционная единица млекопитающих и составляющие ее сигнальные последовательности. На этой схеме показана также организация участков, расположенных выше точки начала транскрипции, у рано экспрессируемых генов вируса SV40 млекопитающих и гена, кодирующего гистон Н2А у морского ежа. Оба участка содержат регуляторные сайты, расположенные на 200 пар нуклеотидов выше точки начала транскрипции. Сам структурный ген начинается с сайта инициации, с которого фактически и начинается транскрипция. Этому сайту соответствует 5'-конец мРНК; в мРНК он модифицирован характерным основанием 7-метилG5'ррр, которое образует кэп, играющий важную роль в трансляции. Инициирующая последовательность, изображенная на рис. 11-7, - это обобщенная последовательность, выведенная путем сопоставления инициирующих последовательностей нескольких генов. На самом деле эти последовательности сильно варьируют. В них имеется несколько внутренних сигнальных последовательностей, в том числе сайт начала трансляции, сигналы сплайсинга на границах между нитронами и кодирующими последовательностями и сайты, определяющие терминацию транскрипции и добавление полиадениловых фрагментов к 3'-концу мРНК.
Рис. 11-7. Сигнальные последовательности, ассоциированные с генами эукариот. Вверху представлена идеализированная транскрипционная единица млекопитающих. ТАТА-блок, который, возможно, участвует в связывании РНК-полимеразы, лежит у 5'-конца гена. Транскрипция начинается с сайта кэпа, который лежит на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов. Кодирующие последовательности показаны черным; единственный показанный на схеме интрон покрыт пунктиром. К внутренним сигналам относятся сайты сплайсинга и сайты терминации и аденилирования. На схеме раннего промоторного участка вируса SV40 показаны две последовательности из 70 пар оснований (заштрихованы), расположенные на расстоянии 116 нуклеотидных пар от сайта начала транскрипции в сторону 5'-конца. Эти последовательности необходимы для экспрессии раннего участка вируса SV40 in vivo. На нижней схеме показана начальная область (с 5'-конца) для одного из членов кластера гистоновых генов морского ежа. Участок А содержит эволюционно консервативную последовательность, участок В - ТАТА-блок, а участок С - сайт кэпа. Воздействие делений этих участков на транскрипцию рассмотрено в тексте. (Lewin, 1980; Benoist, Chambon, 1981; Mathis, Chambon, 1981; с изменениями. Grosschedl, Birnstiel, 1980.)
Особый интерес для понимания регуляции транскрипции генов в процессе развития представляют, однако, регуляторные сайты, расположенные выше точки начала транскрипции. Наиболее хорошо известна последовательность ТАТАААА (ТАТА-блок, или ТАТА-бокс), лежащая на расстоянии примерно 30 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции. Эта последовательность очень сходна с сайтом узнавания РНК-полимеразы, впервые обнаруженным Прибновом (Pribnow) у бактерий и необходимым для транскрипции бактериальных генов. ТАТА-блок необходим для транскрипции генов эукариот в системе in vitro, но, как показали эксперименты, проведенные недавно Бенуа и Шамбоном (Benoist, Chambon), Матисом и Шамбоном (Mathis, Chambon) и Гросшедлом и Бирнстилом (Grosschedl, Birnstiel), при транскрипции in vivo в ТАТА-блоке нет необходимости. Если ввести в ооциты Xenopus клонированные гены, они точно транскрибируются. Можно вызвать делеции определенных участков и ввести в ооциты такие модифицированные гены. При этом можно определить как скорость транскрипции, так и последовательность образующейся РНК. Путем таких экспериментов было установлено, что гены, из которых был удален ТАТА-блок, транскрибируются почти с такой же скоростью, как обычно, но что транскрипция инициируется в нескольких сайтах, которые в нормальных генах не используются. Таким образом, последовательность ТАТА определяет сайт инициации, с которого РНК-полимераза начинает транскрипцию; однако этот сайт не является абсолютно необходимым для связывания РНК-полимеразы или для начала транскрипции.
