Скулачев Петрович - Рассказы о биоэнергетике
В подтверждение своей правоты я привел данные опытов, поставленных А. Глаголевым на пурпурной фотосинтезирующей бактерии. Испытывая различные комбинации ферментных ядов и разобщителей-протонофоров, Глаголев показал, что скорость движения микроба пропорциональна величине протонного потенциала, а не количеству АТФ. Это был важный шаг вперед по двум причинам.
Во-первых, стало ясно, что эффект Адлера не есть некое исключительное свойство или следствие «уродства», присущее одному только мутанту кишечной палочки. Скорее это характерная черта дыхательного аппарата бактерий вообще, поскольку она проявляемся и у мутанта кишечной палочки, и у столь отдаленного в эволюционном отношении вида, как пурпурная бактерия-фотосинтетик, причем нормальный, а не мутантцый штамм. Существенно, что в качестве исходного энергетического ресурса для движения эти бактерии в отличие от кишечной палочки использовали свет, а не дыхание.
Во-вторых, Глаголев не в пример Адлеру «знал, где искать»: он мерил не только АТФ и скорость движения, но и мембранный потенциал. Обнаруженная им линейная зависимость между скоростью движения и потенциалом явилась сильным доводом в пользу нашей рабочей гипотезы.
Тем не менее нужен был прямой эксперимент. И он был вскоре поставлен.
Мы рассуждали таким образом. Если свет у нашей бактерии (или дыхание у кишечной палочки) нужен для движения только постольку, поскольку за их счет генерируется протонный потенциал, то можно получить подвижность и в отсутствие света (или дыхания), создав этот потенциал искусственно. Как это сделать?
Прежде всего необходимо перекрыть все пути образования протонного потенциала белками-генераторами. Затем к таким неподвижным уже бактериям надо добавить, например, кислоту, но не столько, чтобы, избави бог, их убить, а небольшое количество, которое просто создало бы некоторую избыточную концентрацию ионов водорода во внешней среде по сравнению с цитоплазмой бактериальной клетки. Поскольку в обычных условиях протонные генераторы бактерий откачивают ионы Н+ из клетки во внешнюю среду, то добавка кислоты должна имитировать включение генераторов.
С нетерпением я ждал результата этого опыта. Исполнится ли удивительное предсказание гипотезы: очнутся ли от паралича бактерии, отравленные целым коктейлем ядов, если в среду просто добавить немного соляной кислоты?
Опыт такого типа называют «острым». Гипотеза, положенная в основу острого опыта, выбирает из множества один-единственный вариант ответа системы на предполагаемое воздействие. Бактерии неподвижны из-за нехватки энергии. Так почему бы не добавить к ним АТФ — энергетический ресурс всех уже известных механизмов биологической подвижности? Или какой-нибудь другой нуклеозидтрифосфат, пирофосфат, фосфоэнолпируват, ацетилфосфат, ацетилкофермент А, то есть вещества, известные своей способностью оплачивать энергозатраты на отправление определенных биологических функций? А если уж менять рН среды, то почему добавлять кислоту, а не щелочь?
Из всех этих возможностей гипотеза «протонного мотора» прямо указывала на одну. «Добавь кислоты, и они задвигаются!» — подсказывала гипотеза Глаголеву, наблюдавшему в микроскоп обездвиженные бактерии. Они беспомощно броунировали в капле ядовитого раствора, как если бы это были не живые существа, а крупинки китайской туши. Рядом, на том же предметном стекле, — капелька кислоты. Глаголев осторожно смешивает две капли. Что это? Поплыла одна, другая, третья — и вот уже во всем поле зрения появились подвижные бактерии, проворно и как-то деловито, осмысленно снующие в самых различных направлениях.
Удача? А может быть, капля кислоты просто разбавила яды?
Опыт повторяется, но вместо кислоты берется капелька воды. Нет эффекта: бактерии по-прежнему неподвижны. Еще один контроль: вместо кислоты добавляется щелочь. Эффекта нет и в этом случае.
А вдруг кислота разрушила какой-то из ядов? Это крайне маловероятно: ведь изменение кислотности среды в общем-то невелико. И тем не менее...
В работе с такой сложной системой, как живое существо, пусть даже мельчайшее, одноклеточное, всегда можно найти несколько объяснений любому факту. Однако стоящая гипотеза тем и хороша, что она не только объясняет старые факты, но и предсказывает новые. Именно так было установлено, что подвижность возвращается при добавке кислоты к отравленным ядами бактериям.
Что же, отправимся дальше по пути, указанному гипотезой. Легко сообразить, что движение, вызванное кислотой, должно быть явлением временным. По мере поступления ионов водорода в бактерию кислотность внутри клетки должна повышаться, так что в конце концов внутри станет так же «кисло», как снаружи. Это значит, что протонный потенциал рассеется и бактерия остановится.
Известно, что время, необходимое, чтобы уравнялись концентрации ионов Н+ между бактерией и средой, измеряется несколькими минутами. Значит, вызванное кислотой движение должно прекратиться спустя минуты.
И действительно, через три минуты после добавки кислоты поле под микроскопом являло собой печальную картину, которую мы наблюдали в начале опыта: бактерии были неподвижны.
Вот вам и разрушение яда кислотой! Что же это он сначала разрушился, а потом, когда кислота проникла в клетку, опять образовался?
Конечно, нет.
А может быть, вообще клетка становится неподвижной, когда цитоплазма подкислилась?
Все может быть. Но заметьте, каждый следующий факт, предсказанный нашей гипотезой, требует от оппонента какого-нибудь нового предположения. Наша точка зрения ведет к новым фактам, противоположная — к новым предположениям.
И все же проверим, как влияет сама по себе кислотность среды на движение бактерий. Исключим из среды яд, мешавший производству протонного потенциала за счет света, и посмотрим, не обездвижутся ли бактерии при подкислении среды. Оказывается, этого не происходит. В подкисленной среде бактерии весело плавают до тех пор, пока не выключишь свет.
Итак, к чему же мы пришли? Протонный потенциал движет бактерией. Но как? Есть только один путь: ионы Н+ входят в бактерию и «походя» вращают М-диск, а с ним и всю флагеллу. Почему ионы Н+ идут внутрь клетки? Да просто потому, что их снаружи больше, чем внутри. Ведь не зря же мы добавили НС1, которая в воде полностью диссоциирует на Н+ и Сl-.
Если все это так, можно включить механизм движения и другим способом: создать, например, внутри клетки избыток отрицательных зарядов. Тогда даже при равенстве концентраций ионов Н+ внутри и снаружи клетки эти ионы будут поступать внутрь за счет электрических сил, перемещаясь от плюса к минусу.
Сказано - сделано! На стекле две капли. В одной неподвижные, отравленные ядовитой смесью бактерии, в другой еще один яд, антибиотик валиномицин. Этот агент резко повышает проницаемость мембран для ионов калия (К+).
Раствор валиномицина, как и среда с бактериями, не содержит ионов К+. В то же время внутри бактерий много этих ионов. Если теперь слить две капли, то валиномицин атакует бактерии, повысит их калиевую проницаемость и разрешит ионам К+ выйти из бактерии, где их избыток по сравнению с окружающим раствором.
Выходя, ионы К+ зарядят внутренность клетки отрицательно, этот минус притянет К+, и, двигаясь внутрь, Н+ запустит протонный мотор. Бактерии поплывут. Таково предсказание гипотезы.
А что получилось в опыте на самом деле? Бактерии задвигались и вновь через положенное время, когда уравнялись концентрации К+ внутри и снаружи клетки, остановились.
Предвидя новое возражение оппонента (а вдруг валиномицин работал у нас не переносчиком калия, а кем-то еще), мы поставили контрольный эксперимент, где бактерии находились в среде с высоким содержанием калия. Теперь калия было много и внутри и снаружи клетки. В таких условиях валиномицин не включал механизма подвижности. Эффект валиномицина (а также и кислоты) можно было снять и другим способом: добавив в среду разобщитель-протонофор и тем самым сведя к нулю протонный потенциал.
Наши данные по движению пурпурных бактерий были опубликованы у нас в «Биохимии» и за рубежом — в «Нэйчер», Вскоре появились сообщения из США и Японии, где аналогичные результаты получились в опытах на стрептококке и Bacillus subtilis. Параллельно мы проделали такую же работу с классическим объектом микробиологов — кишечной палочкой.
А совсем недавно Т, и А. Глаголевыми и М. Гусевым и К. Никитиной было доказано, что нитчатые сине-зеленые водоросли также используют протонный потенциал для своего скользящего движения по поверхности твердого субстрата.
Это последнее наблюдение свидетельствует, что протонный мотор, однажды изобретенный природой, применяется не только у бактерий, имеющих жгутики. У сине-зеленых водорослей жгутиков нет. Их роль выполняют, по-видимому, фибриллы, лежащие между внешней и цитоплазматической мембранами этих организмов, Сине-зеленые водоросли относятся к царству бактерий (у них есть даже другое название — цианобактерии). А могут ли организмы, принадлежащие к высшим царствам живой природы, двигаться за счет протонного потенциала? Чтобы ответить на этот вопрос, мы занялись движением хлоропластов.
