Скулачев Петрович - Рассказы о биоэнергетике
Карфаген должен быть разрушен!
дыхание → протонный потенциал ← АТФ.
Приняв, что второй процесс обратим, мы получим:
дыхание → протонный потенциал → АТФ.
Другими словами, дыхание и фосфорилирование связаны через протонный потенциал,
Синтез АТФ за счет искусственно созданной ΔрН был обнаружен еще А. Ягендорфом. O том, что Δψ также может служить источником энергии для фосфорилирования, говорили опыты Б. Прессмана, поставленные в 1967 году. Митохондрии выдерживали с ионами калия и затем помещали в среду без калия. Для повышения калиевой проводимости мембран добавляли валиномицин. Выход ионов калия из митохондрий в бескалиевую среду создавал нехватку положительных зарядов внутри митохондрий. Если бескалиевая среда содержала АДФ и фосфат, то синтезировался АТФ.
Сопоставив эти данные с результатами опытов, описанных выше, я решил, что настало время объявить о доказательстве Митчелова принципа сопряжения.
Доклад на Европейском биохимическом съезде в Варне в 1971 году показался мне подходящим случаем, чтобы выступить с этим заявлением.
Бог мой, что тут началось! После более чем оживленной дискуссии, выплеснувшейся в кулуары конгресса, один из оппонентов заметил, что даже Митчел, отсутствовавший в Варне, вряд ли счел бы мое выступление своевременным. Действительно, спустя некоторое время я получил конверт со штемпелем «Бодмин» и посланием Митчела, где он писал, что считает меня слишком большим энтузиастом хемиосмотической теории.
Мы вновь увиделись с ним через год, на следующем съезде европейских биохимиков. Митчел председательствовал на моей лекции, и я не без волнения вновь показал уже несколько затертый заключительный слайд своего варненского доклада, сопроводив его латынью: «Ceterum censeo Carthaginem delendam esse!» («При всем том я думаю, что Карфаген должен быть разрушен!»)
Председатель уже не возражал. Видно, латынь пришлась по душе выпускнику колледжа Иисуса в Кембридже! Желтые глаза Митчела лучились, он, кажется, даже приоткрыл от удовольствия рот, показав язык нашим оппонентам в зале,
- Вы будете держать флаг, - сказал мне Митчел, уезжая в Англию накануне постсимпозиума по биоэнергетике, где предполагалось нелицеприятное обсуждение конкурирующих теорий. Он вообще (а после Варшавы в особенности) не любил открытых дискуссий.
— Мой компьютер работает медленно, — говорил он, постукивая пальцем по своему высокому лбу.
Бой на постсимпозиуме пришлось принять мне.
Что же возразили наши противники?
Их главный аргумент состоял в том, что митохондрия слишком сложна, чтобы имеющийся в наших руках материал был достаточен для вывода о сопрягающей роли протонного потенциала.
- Почему вы думаете, — спрашивали меня, - что протонный потенциал стоит между дыханием и АТФ, а не где-нибудь в стороне? Например:
дыхание → АТФ → протонный потенциал или
протонный потенциал → дыхание → ? → АТФ?
Напрасно я говорил о том, что хемиосмотической гипотезой предсказаны явления, мысль о существовании которых не могла даже прийти в голову, если придерживаться любой другой схемы. Оппоненты были неумолимы. Практически все маститые биоэнергетики, присутствовавшие в зале, не разделяли моей точки зрения.
После истории с Уэбстером и Грином, Пэйнтери Хантером они уже ничему не верили на слово. Каждый хотел на собственном опыте убедиться в правоте логического построения и отсутствии альтернативных объяснений.
Протеолипосомы
Итак, к 1972 году дискуссия между сторонниками хемиосмотической теории и ее противниками переместилась в новую плоскость. Если раньше ставилось под сомнение само существование протонного потенциала, то теперь речь шла лишь о том, как образуется этот потенциал и какова его роль в энергетике клетки.
Очередной вопрос, на который предстояло ответить, состоял в следующем: действительно ли есть два пути образования протонного потенциала: один, использующий энергию дыхания, и другой, использующий энергию АТФ, или существует лишь один такой путь (либо дыхание, либо АТФ).
Протеолипосомы
Чтобы решить эту проблему, необходимо было разделить ферменты, участвующие в дыхании и гидролизе АТФ, и показать, что каждый из них, взятый в отдельности, может образовать протонный потенциал. Следовало сперва разобрать мембрану митохондрий на части — разделить белки и липиды, потом очистить какой-либо один тип белков, например дыхательный фермент, и после этого посмотреть, может ли этот фермент образовать протонный потенциал.
— Позвольте, - возразите вы, — но ведь протонный потенциал — это трансмембранная потенциальная энергия протонов, а мембрану-то мы уже разрушили!
— Ну и что? Сначала разрушили, а теперь сделаем, да такую, что в ней будет только один тип белков - дыхательный фермент!
— А если природная мембрана, однажды разрушенная, вообще не может быть воссоздана? Если мембрана происходит от мембраны, как клетка от клетки?
— Волков бояться — в лес не ходить.
Э. Ракер волков не боялся (хотя бы потому, что, как говорят, в штате Нью-Йорк они давно вывелись). И вот в Корнелльском университете началась работало самосборке мембран. Многие месяцы подряд японский стажер Я. Кагава испытывал разные белки, фосфолипиды и способы разрушения мембран, пока наконец один из вариантов опыта не принес надежду на успех. Взяв фосфолипиды из сои и фермент АТФазу из митохондрий бычьего сердца, Кагава растворил их в воде с помощью одной из желчных кислот. Затем он осторожно удалил желчную кислоту и обнаружил, что в растворе получились пузырьки, способные расщеплять АТФ. Скорость распада АТФ повышалась динитрофенолом, что могло бы свидетельствовать о генерации протонного потенциала на мембранах пузырьков.
Незадолго до опытов Кагавы в лабораторию Ракера возвратился из годичной стажировки П. Хинкль, посланный Ракером к Митчелу на выручку. Хинкль не только освоил новую теорию, но и провел в Глинн Хаузе ряд изящных опытов с митохондриями, исследуя один из дыхательных ферментов, цитохромоксидазу. Вернувшись в Итаку, Хинкль заразил Ракера своим митчельянством так, что тот стал первым из признанных корифеев биоэнергетики, кто поддержал Митчела.
Если АТФаза и АТФ-синтетаза, рассуждали Ракер и Хинкль, — это один и тот же фермент, а роль дыхания состоит только в том, чтобы образовать протонный потенциал, необходимый для фосфорилирования, тогда стоит лишь включить в АТФазные пузырьки Кагавы еще и дыхательный фермент, как они, эти пузырьки, начнут образовывать АТФ за счет дыхания.
Ракер засучил рукава белоснежного халата и взялся встраивать цитохромоксидазу в АТФазные пузырьки Кагавы.
Вскоре в американском биохимическом журнале появилось сенсационное сообщение, подписанное Э. Ракером и его лаборанткой А. Кандраш, о самосборке системы дыхательного фосфорилирования. Пузырьки, содержащие АТФазу и цитохромоксидазу, образовывали АТФ при окислении аскорбиновой кислоты. Синтез АТФ полностью прекращался добавлением разобщителей-протонофоров.
Услышав об открытии Ракера, я попросил А. Ясайтиса наладить получение таких же пузырьков здесь, в Москве. Сказано — сделано! И вот уже передо мной три пробирки: водной пузырьки с АТФазой, в другой — с цитохромоксидазой, а в третьей — с двумя этими ферментами вместе. Попробовали проникающие ионы. Как и следовало ожидать, в белково-липидных пузырьках происходил электрофорез синтетических ионов.
Источниками энергии для транспорта наших ионов могли служить: в АТФазных пузырьках — гидролиз АТФ, в цитохромоксидазных — дыхание, а в смешанных — оба эти процесса. Восстановителем цитохромоксидазы служил водорастворимый белок цитохром с.
Удалось приготовить цитохромоксидазные пузырьки двух типов: одни с цитохромом с внутри и другие с цитохромом с снаружи. В первом случае внутренность пузырьков должна заряжаться положительно, во втором — отрицательно. Чтобы проверить, правильно ли это предположение, были взяты два очень близких по структуре, но разных по заряду иона — ТФБ- и ТФФ+. Оказалось, что при дыхании пузырьки с цитохромом с внутри поглощают ТФБ-, а пузырьки с цитохромом с снаружи поглощают ТФФ+.
Так сбылось еще одно предсказание гипотезы, а в целом был сделан новый шаг вперед. Теперь я уже мог ответить моим критикам: протонный потенциал есть общий продукт двух разных ферментативных систем — дыхательной и АТФазной.
Вообще мне чрезвычайно понравились эти самые фосфолипидные пузырьки, инкрустированные очищенным белком, — простейшая модель, где еще сохранялась интересовавшая нас функция, то есть преобразование химической энергии в электрическую. Я назвал такие пузырьки протеолипосомами, и это имя, кажется, прижилось.
