Александр Марков - Рождение сложности: Эволюционная биология сегодня
Исследование проводилось на грибе Neurospora crassa, известном широкой публике как розовая хлебная плесень. По иронии судьбы, на этом же объекте в 40-е годы прошлого века были получены сенсационные результаты, позволившие сформулировать принцип "один ген — один белок". Сейчас на нейроспоре изучают альтернативный сплайсинг — явление, опровергающее (или, лучше сказать, уточняющее и расширяющее) этот замечательный принцип.
У нейроспоры, как и у ряда других эукариот, в генах, участвующих в биосинтезе тиамина (витамина В1, были обнаружены участки, сходные с известными бактериальными РНК-переключателями, которые реагируют на производное тиамина — тиамин-пирофосфат. Большинство известных РНК-переключателей действуют по принципу отрицательной обратной связи. Они реагируют на вещество, синтезируемое белковым продуктом данного гена, и при достаточно высокой концентрации этого вещества отключают ген.
Примерно то же самое наблюдалось и в данном случае. Повышение концентрации тиамин-пирофосфата в клетках гриба приводит к снижению производства белков, ответственных за синтез тиамина. Было показано, что если удалить из соответствующих генов участки, похожие на бактериальные РНК- переключатели, то производство тиамин-синтезирующих белков перестает зависеть от концентрации тиамин-пирофосфата.
Таким образом, стало ясно, что участки грибных генов, похожие на РНК-переключатели, действительно являются таковыми. Оставалось лишь выяснить механизм их действия, то есть понять, как они блокируют работу "своих" генов. У бактерий РНК-переключатели делают это либо на этапе транскрипции (первичного "прочтения" гена), либо на этапе трансляции — синтеза белка на матрице мРНК.
У эукариот, как выяснилось, дело обстоит иначе — работа гена блокируется на этапе сплайсинга. Бактериям это недоступно, поскольку у бактерий сплайсинга нет (почти нет, если быть точным). Тиаминовый РНК-переключатель в генах Neurospora crassa располагается в первом интроне, недалеко от начала гена. Если в клетке мало тиамин-пирофосфата, РНК- переключатель "приклеивается" одной из своих петель к строго определенному месту на молекуле мРНК. Это место является одним из потенциальных мест сплайсинга, то есть именно здесь в ходе сплайсинга молекула мРНК может быть разрезана. Однако приклеившийся РНК-переключатель не позволяет этого сделать, и молекула разрезается в другом подходящем месте по соседству. В результате формируется "правильная" зрелая мРНК, на основе которой синтезируется полноценный белок.
Если же в клетке много тиамин-пирофосфата, это вещество присоединяется к РНК-переключателю и изменяет его форму. Переключатель "отклеивается" от места сплайсинга и перестает его защищать. Тогда молекула РНК режется именно в этом месте, которое раньше прикрывалось РНК-переключателем. Это в конечном счете приводит к формированию "бракованной" зрелой мРНК, на базе которой полноценный белок синтезировать невозможно.
Таким образом, РНК-переключатель в зависимости от концентрации тиамин-пирофосфата направляет сплайсинг по одному из двух альтернативных путей.
На этом рисунке показано, как РНК-переключатель регулирует альтернативный сплайсинг у розовой хлебной плесени (на примере гена NMT1). Участок мРНК, вырезаемый при сплайсинге, отмечен пунктирными линиями и серыми стрелками. При низкой концентрации тиамин-пирофосфата РНК-переключатель "защищает" потенциальный сайт (место) сплайсинга, отмеченный значком в виде буквы "Т". В результате при сплайсинге вместо этого сайта используется другой, расположенный по соседству (серая стрелка). Участок мРНК, отмеченный белым цветом, не попадает в зрелую мРНК. При высокой концентрации ТРР это вещество связывается с РНК-переключателем и меняет его конфигурацию. В результате молекула РНК режется в том месте, которое раньше было прикрыто РНК-переключателем, белый участок попадает в зрелую РНК и "портит" ее.
Судя по некоторым косвенным признакам, регуляция сплайсинга при помощи РНК-переключателей может быть довольно широко распространена у эукариот. Чтобы проверить это предположение, необходима разработка эффективных методов поиска РНК-переключателей в эукариотических геномах — эти методы пока еще далеки от совершенства.
Еще одна неожиданная функция РНК обнаружилась недавно в ходе изучения механизмов репарации — починки повреждений в ДНК. Оказалось, что молекулы РНК могут играть роль матриц, информация с которых переписывается в поврежденную молекулу ДНК взамен утерянной (Storici Е, Bebenek К., Kunkel Т. A., Gordenin D. A., Resnick М. А. RNA-templated DNA repair // Nature. 2007. V 447. P. 338-341.). Процесс основан на обратной транскрипции (как мы помним из предыдущей главы, так называют переписывание информации из РНК в ДНК, то есть синтез ДНК на РНК-матрице). Изобретение обратной транскрипции, между прочим, должно было стать важным переломным моментом в развитии РНК-мира, поскольку позволило РНК-организмам перейти к хранению наследственной информации в более надежной и стабильной форме молекул ДНК. В предыдущих главах мы упоминали несколько случаев использования обратной транскрипции современными организмами: это перемещение и размножение ретротранспозонов и ретровирусов, образование ретропсевдогенов, восстановление укорачивающихся при каждом клеточном делении кончиков хромосом — теломер. И вот еще один пункт добавился к этому списку — репарация ДНК.
Если молекула ДНК повреждена — например, подверглась разрыву, — для ее починки необходима матрица, в которой последовательность нуклеотидов соответствует исходному, "правильному" состоянию поврежденного участка. Ранее считалось, что в качестве таких матриц всегда используются другие молекулы ДНК.
Потом выяснилось, что иногда эти ДНК-матрицы синтезируются путем обратной транскрипции на основе РНК при участии ретротранспозонов.
Наконец, совсем недавно ученые из Национального института экологии здоровья (США) сумели показать, что репарация возможна и непосредственно на основе РНК-матриц без предварительного изготовления ДНК-матрицы и без участия специфических ферментов — обратных транскриптаз, кодируемых ретротранспозонами.
Исследователи искусственно вызывали у дрожжей разрыв хромосомы в одном и том же строго определенном месте. Затем в клетки добавляли искусственно синтезированные короткие молекулы РНК, последовательности нуклеотидов в которых соответствовали участкам поврежденной хромосомы по краям разрыва. Оказалось, что эта процедура повышает вероятность успешной "починки" разорванной хромосомы в 500 раз.
Два основных способа "починки * разрывов двойной спирали ДНК. Первый способ (негомологичное соединение концов) чреват неточностями — потерей или вставкой лишних нуклеотидов в районе разрыва. Второй более точен, но требует наличия "запасной копии" поврежденного фрагмента ДНК. Как выяснилось, эта запасная копия не обязательно должна быть двухцепочечной ДНК (как показано на рисунке), годится и одноцепочечная ДНК и даже РНК.
Если в середину молекулы РНК, служащей матрицей для репарации, ввести несколько лишних нуклеотидов, они потом обнаруживаются в "починенной" хромосоме как раз между сшитыми краями разрыва. Это свидетельствует о синтезе ДНК на матрице РНК, то есть об обратной транскрипции.
Кроме того, это говорит об отсутствии принципиальных преград для переписывания информации из РНК в ДНК в живых клетках, что может иметь большое значение для эволюции. Уже целый ряд фактов указывает на то, что молекулы РНК иногда могут служить чем-то вроде "резервных копий" особо важных "файлов", записанных в геномной ДНК, и при потере каких-то фрагментов информации (даже целых генов!) эти резервные копии могут идти в ход. Мы уже знаем три таких примера (описанные в главе "Управляемые мутации" геномные перестройки у инфузорий, парамутации, участие РНК в репарации), а есть и другие, не поместившиеся в эту книгу. Ясно, что все это открывает большие возможности для эволюции, хотя о том, в какой мере и для чего именно они используются, мы пока можем только гадать.
Сравнение геномов человека и мыши помогло обнаружить новый способ регуляции работы генов. Ну и напоследок — еще одно недавнее открытие, которое как нельзя лучше показывает, что наши знания об устройстве и функционировании живой клетки до сих пор крайне неполны, а сложность и запутанность механизмов внутриклеточной регуляции далеко превосходит все, что мы еще недавно могли себе представить.
В основе нового способа генной регуляции, только что открытого биологами из Калифорнийского университета в Беркли, лежит уже знакомый нам альтернативный сплайсинг, а также еще один механизм, называемый nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Это можно перевести как "разрушение мРНК, опосредуемое бессмыслицей". Данный механизм представляет собой нечто вроде "внутриклеточной цензуры". Он служит для уничтожения заведомо бессмысленных молекул РНК. Особые молекулярные системы, о которых пока мало что известно, идентифицируют зрелую (то есть прошедшую сплайсинг) мРНК как бессмысленную и приговаривают ее к уничтожению в том случае, если в ней имеется "преждевременный" стоп-кодон (три нуклеотида, сигнализирующие об окончании синтеза белка). В норме стоп-кодон должен располагаться в конце каждого гена. Но в результате мутации он может образоваться в середине гена. В этом случае синтез белка обрывается преждевременно, и весь ген становится бессмысленным. Именно для выявления и "обезвреживания" таких мутаций и существует система NMD.
